expt2-瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)，檢測(cè)質(zhì)粒DNA。帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳。瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)在堿性緩沖液中DNA分子帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)二、原理在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型瓊脂糖凝膠電泳不僅可以分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子可以分離長(zhǎng)度為100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三種緩沖體系二、原理瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分離范圍參數(shù)

凝膠濃度（%）線性DNA長(zhǎng)度（bp）

0.51000～300000.7800～120001.0500～100001.2400～70001.5200～30002.050～2000發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌，偶見于鏈霉菌和酵母本質(zhì)是細(xì)菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，是一種簡(jiǎn)單的，雙鏈環(huán)狀DNA分子(只有酵母的殺傷質(zhì)粒是RNA質(zhì)粒)，能自主復(fù)制。比病毒還簡(jiǎn)單的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，一旦離開寄主細(xì)胞則無法繁殖。質(zhì)粒雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）開環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）細(xì)胞內(nèi)：超螺旋環(huán)狀共價(jià)雙鏈DNA分子(ccc-DNA)細(xì)胞外：超螺旋(sc)、開環(huán)(oc)，線形(L)

在變性條件下,可成為單鏈DNA分子（ss）質(zhì)粒的存在形式質(zhì)粒DNA分子的三種構(gòu)型，即CCCDNA、OCDNA和LDNA，在凝膠電泳中的泳動(dòng)率不同，因此電泳后呈三條帶，CCCDNA泳動(dòng)最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNAEB：即溴化乙錠，它能夠插入DNA分子中的堿基對(duì)之間而與DNA結(jié)合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測(cè)。可以檢測(cè)10ng的DNA注意：EB是一種誘變劑，操作時(shí)一定要注意安全，必須戴塑料或乳膠手套CCCDNALDNAOCDNA電泳方向三、儀器、材料與試劑微波爐瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)質(zhì)粒DNADNAmarker50×TBE6×凝膠加樣緩沖液(含溴酚藍(lán))瓊脂糖1％溴化乙錠溶液溶解瓊脂糖分離質(zhì)粒DNA片段檢測(cè)質(zhì)粒DNA片段電泳樣品DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物電泳緩沖液沉淀DNA并起指示作用電泳支持介質(zhì)嵌入DNA中，在紫外燈下顯色四、實(shí)驗(yàn)步驟將1g瓊脂糖加入100ml1×TBE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解（冷卻到60℃，加入5μl的1％EB，并搖勻），則為1％瓊脂糖凝膠液用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TBE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠0.5cm，小心垂直向上拔出梳子1.瓊脂糖凝膠的制備用移液器吸取質(zhì)粒樣品5ul于手套上，再加入1μl的6×加樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3～5V/cm（本實(shí)驗(yàn)用電壓110V），可見溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝