沙門氏菌的檢測(cè) 5

沙門氏菌的檢測(cè)授課教師：汪清美一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握沙門氏菌屬的檢測(cè)方法2.了解沙門氏菌的基本生化反應(yīng)及原理二、實(shí)驗(yàn)器材1.菌種：沙門氏菌、大腸桿菌2.檢樣：鮮雞蛋3.培養(yǎng)基：四硫磺酸鈉黃綠（TTB）增菌液；氯化鎂孔雀綠增菌液（MM)；亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液；亞硫酸鉍（BS）瓊脂；HE瓊脂；SS瓊脂；三塘鐵瓊脂（TSI）4.設(shè)備：冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、均質(zhì)器、振蕩器、電子天平、無菌錐形瓶、無菌吸管、無菌培養(yǎng)皿、無菌試管、無菌毛細(xì)管1.四硫磺酸鈉黃綠（TTB）增菌液基礎(chǔ)液900mL硫代硫酸鈉溶液100mL碘溶液20.0mL煌綠水溶液2.0mL牛膽鹽溶液50.0mL臨用前，按上列順序，以無菌操作依次加入基礎(chǔ)液中，每加入一種成分，均應(yīng)搖勻后再加入另一種成分。蛋白胨10.0g

蒸餾水1000mLpH7.0±0.2

牛肉膏5.0g氯化鈉3.0g碳酸鈣45.0g（碳酸鈣可以調(diào)節(jié)ph,是培養(yǎng)基在養(yǎng)菌過程中維持一定ph,否則ph過低,影響菌株生長(zhǎng)另外還有篩選產(chǎn)酸菌的作用）除碳酸鈣外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，再加入碳酸鈣，調(diào)節(jié)pH，高壓滅菌121℃，20min基礎(chǔ)液硫代硫酸鈉溶液硫代硫酸鈉（含5個(gè)結(jié)晶水）50.0g蒸餾水加至100mL高壓滅菌121℃，20min。（硫代硫酸鈉作為中和劑，可以滅菌121,15min，沒有影響的，檢驗(yàn)含有次氯酸鈉的消毒水微生物，需要加入1.5%硫代硫酸鈉溶液；培養(yǎng)基中硫代硫酸鈉和磺所生成的四硫磺酸，能抑制大部分大腸埃希氏菌的生長(zhǎng)，而傷寒與副傷寒沙門氏菌仍能生長(zhǎng)，因?yàn)樯抽T氏菌具有四硫磺酶，能分解四硫磺酶。）

ＴＴＢ培養(yǎng)基使用方法和注意事項(xiàng)

1.使用方法：稱取本品93.55g，溶解于1050ml蒸餾水中，加熱溶解，臨用前加入20％碘液20ml,0.5g煌綠2ml。2.注意事項(xiàng)：ＴＴＢ培養(yǎng)基不加碘液可在4-10度冰箱保存。加入碘液后必須在幾小時(shí)內(nèi)使用。培養(yǎng)基中有白色碳酸鈣沉淀為正?，F(xiàn)象。3.原理：四硫酸鈉是由硫代硫酸鈉和碘經(jīng)氧化生成而來，它對(duì)大腸菌群有抑制作用，對(duì)沙門氏菌無影響。因沙門氏菌具有四硫磺酸酶，能分解四硫磺酸鈉，而大腸菌群沒有這種酶，故生長(zhǎng)受抑制。碳酸鈣為緩沖劑，可使沙門氏菌不致因酸堿度改變而死亡。2.氯化鎂孔雀綠增菌液（MM)甲液：胰蛋白胨5g；磷酸二氫鉀1.6g；氯化鈉8g蒸餾水1000ml；2.乙液：氯化鎂40g；蒸餾水100ml3.丙液：0.4%孔雀綠水溶液4.制法:上述成分配好后，121度高壓滅菌15min，臨用時(shí)取甲液90ml；乙液9ml丙液0.9mlMM增菌液各成分的作用胰蛋白胨提供氮源和碳源滿足細(xì)菌生長(zhǎng)的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；磷酸二氫鉀是緩沖劑；氯化鎂可以增加培養(yǎng)基的滲透壓；孔雀綠抑制非沙門氏菌的生長(zhǎng)，較低的pH結(jié)合氯化鎂和孔雀綠使培養(yǎng)基具有較高的選擇性。3.亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液成分蛋白胨5.0g

乳糖4.0g

磷酸氫二鈉10.0g亞硒酸氫鈉4.0g

L-胱氨酸0.01g

蒸餾水1000mLpH7.0±0.2制法除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以無菌操作加入亞硒酸氫鈉和1g/LL-胱氨酸溶液10mL（稱取0.1gL-胱氨酸，加1mol/L氫氧化鈉溶液15mL，使溶解，再加無菌蒸餾水至100mL即成，如為DL-胱氨酸，用量應(yīng)加倍）。搖勻，調(diào)節(jié)pH。SC增菌液各成分的作用蛋白胨提供碳源滿足細(xì)菌生長(zhǎng)的需求，乳糖是可發(fā)酵的糖類；亞硒酸氫鈉抑制革蘭氏陽性菌和非沙門氏菌的大多數(shù)革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，磷酸鹽是緩沖劑，L-胱氨酸為還原劑。4.亞硫酸鉍（BS）瓊脂蛋白胨10.0g

牛肉膏5.0g

葡萄糖5.0g硫酸亞鐵0.3g

磷酸氫二鈉4.0g煌綠0.025g或5.0g／L水溶液5.0mL檸檬酸鉍銨2.0g

亞硫酸鈉6.0g瓊脂18.0g～20g

蒸餾水1000mL

pH7.5±0.2將前三種成分加入300mL蒸餾水（制作基礎(chǔ)液），硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉分別加入20mL和30mL蒸餾水中，檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉分別加入另一20mL和30mL蒸餾水中，瓊脂加入600mL蒸餾水中。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。冷至80℃左右時(shí)，先將硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉混勻，倒入基礎(chǔ)液中，混勻。將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉混勻，倒入基礎(chǔ)液中，再混勻。調(diào)節(jié)pH，隨即傾入瓊脂液中，混合均勻，冷至50℃～55℃。加入煌綠溶液，充分混勻后立即傾注平皿。制法BS培養(yǎng)基的原理1.蛋白胨、牛肉膏粉提供碳源和氮源；2.葡萄糖提供能源3.亞硫酸鉍抑制劑，抑制革蘭氏陽性菌和大腸菌群，但不影響沙門氏菌的生長(zhǎng)；4.磷酸氫二鈉緩沖劑5.硫酸亞鐵用于產(chǎn)生硫化氫，并與鐵反應(yīng)生成黑色沉淀，使陽性培養(yǎng)物在平板上具有金屬光澤的棕色或黑色菌落6.瓊脂是凝固劑5.HE瓊脂基礎(chǔ)成分：蛋白胨12.0g

牛肉膏3.0g

乳糖12.0g

蔗糖12.0g水楊素2.0g

膽鹽20.0g

氯化鈉5.0g

瓊脂18.0g～20.0g蒸餾水1000mL

0.4％溴麝香草酚藍(lán)溶液16.0mLAndrade指示劑20.0mL甲液20.0mL

乙液20.0mL

pH7.5±0.2②甲液的配制硫代硫酸鈉34.0g

檸檬酸鐵銨4.0g

蒸餾水100mL③乙液的配制去氧膽酸鈉10.0g蒸餾水100mL④Andrade指示劑

酸性復(fù)紅0.5g

1mol/L氫氧化鈉溶液

16.0mL

蒸餾水100mL，將復(fù)紅溶解于蒸餾水中,加入氫氧化鈉溶液。數(shù)小時(shí)后如復(fù)紅褪色不全，再加氫氧化鈉溶液1mL～2mL。

制法將前面七種成分溶解于400mL蒸餾水內(nèi)作為基礎(chǔ)液;將瓊脂加入于600mL蒸餾水內(nèi)。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基礎(chǔ)液內(nèi)，調(diào)節(jié)pH。再加入指示劑，并與瓊脂液合并，待冷至50℃～55℃傾注平皿。注:①本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避免降低其選擇性。.HE瓊脂的原理蛋白胨、牛肉膏粉提供碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)乳糖、蔗糖和水楊素為可發(fā)酵的糖類膽鹽、去氧膽酸鈉抑制革蘭氏陽性菌氯化鈉維持均衡的滲透壓硫代硫酸鈉和檸檬酸鐵銨用于檢測(cè)硫化氫的產(chǎn)生，使菌落中心呈黑色瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑溴麝香酚藍(lán)和酸性復(fù)紅為PH指示劑發(fā)酵糖產(chǎn)酸的菌落呈紅色，不發(fā)酵糖的菌落為藍(lán)綠色6.SS瓊脂配方

牛肉粉月示胨乳糖三號(hào)膽鹽枸櫞酸鈉硫代硫酸鈉枸櫞酸鐵中性紅煌綠瓊脂pH值7.0±0.1

5.05.0010.08.58.58.51.00.0250.0003317.0月示胨、牛肉粉提供碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)；乳糖、葡萄糖為可發(fā)酵的糖類；三號(hào)膽鹽、枸櫞酸鈉和煌綠抑制革蘭氏陽性菌及大多數(shù)的大腸菌群和變形桿菌，但不影響沙門氏菌的生長(zhǎng)；硫代硫酸鈉和枸櫞酸鐵用于檢測(cè)硫化氫的產(chǎn)生，使菌落中心呈黑色；中性紅為pH指示劑，可把分解乳糖和不分解乳糖的細(xì)菌鑒別開，前者為紅色菌落，后者為無色菌落發(fā)酵糖產(chǎn)酸的菌落呈紅色，不發(fā)酵糖的菌落為無色；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。SS瓊脂的原理1.前增菌：用無選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的沙門菌恢復(fù)活力;2.選擇性增菌：使沙門氏菌優(yōu)勢(shì)繁殖，大多數(shù)其它細(xì)菌受到抑制;3.選擇性平板分離培養(yǎng)：分離出所需的細(xì)菌;4.生化試驗(yàn)：鑒定分離出來的細(xì)菌是否符合所檢項(xiàng)目的細(xì)菌;5.血清學(xué)鑒定：進(jìn)一步鑒定。1.基本步驟（程序）：加工過的樣品：稱取25g（mL）樣品放入盛有225mL緩沖蛋白胨水（BPW）的無菌均質(zhì)杯，以8000～10000r/min均質(zhì)1~2min，或置于盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)袋，拍擊式均質(zhì)拍打1~2min。液體樣品不需均質(zhì)，振搖混勻。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中（如使用均質(zhì)袋，可直接培養(yǎng)），36±1℃培養(yǎng)8～18h。冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過15min，或2℃~5℃不超過18h解凍。未加工樣品：。。。。。（1）前增菌

輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mL四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液內(nèi)，42℃±1℃培養(yǎng)18～24h。同時(shí)，另取1mL，轉(zhuǎn)種于10mL亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液內(nèi)，36±1℃培養(yǎng)18～24h。SC更適合傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌增菌，最適增菌溫度為36℃±1℃，時(shí)間為18—24h。TTB更適合其他沙門氏菌增菌，最適增菌溫度為42℃±1℃，時(shí)間為18—24h。增菌時(shí)，必須同時(shí)使用SC和TTB，提高檢出率，以防漏檢。（2）增菌（3）分離---選擇性平板分離分別用接種環(huán)取增菌液一環(huán)，劃線接種于選擇性培養(yǎng)基上，分離培養(yǎng)一個(gè)亞硫酸鉍（BS）瓊脂平板，36±1℃培養(yǎng)40～48h一個(gè)木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂平板（或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基），36±1℃培養(yǎng)18～24h。觀察各平板上生長(zhǎng)的菌落，各平板上的菌落的特征見附表。選擇性瓊脂亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ亞屬Ⅲ（亞利桑那菌）BS菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變黑色有金屬光澤HE藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色。乳糖陽性的菌株為黃色、中心黑色或幾乎全黑色，乳糖遲緩陽性或陰性的菌株為藍(lán)綠色或藍(lán)色，中心黑色或幾乎全黑色SS無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌株有的菌落中心帶黑色，但不明顯。乳糖遲緩陽性或陰性的菌株，與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心黑色，但中心無黑色形成時(shí)與大腸埃希氏不能區(qū)別SS瓊脂平板

BS瓊脂BS上的菌落DHL上的菌落SS上的菌落BS＋

XLDHE科瑪嘉顯色培養(yǎng)基平板一種培養(yǎng)基不可能適合所有沙門氏菌的分離，BS選擇性強(qiáng)，更適合分離傷寒沙門氏菌。分離沙門氏菌要同時(shí)用兩種以上的培養(yǎng)基，互補(bǔ)，可提高檢出率，以防漏檢。其中必須有BS。（4）生化試驗(yàn)選擇性瓊脂平板上符合沙門氏菌特征的菌落，只能稱其疑為沙門氏菌，也可能是其他雜菌。五項(xiàng)生化試驗(yàn)：三糖鐵(TSI)試驗(yàn)賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)靛基質(zhì)試驗(yàn)?zāi)蛩丨傊囵B(yǎng)氰化鉀培養(yǎng)基1.三糖鐵(TSI)試驗(yàn)自選擇性瓊脂平板上分別挑取兩個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再底層穿刺，用一空白培養(yǎng)基作對(duì)照試驗(yàn)。2賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)：接種三糖鐵瓊脂的接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于36±1℃培養(yǎng)18～24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h。三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)培養(yǎng)基：乳糖：蔗糖：葡萄糖=10：10：1；加有酚紅本試驗(yàn)可同時(shí)觀察糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。原理：只能利用葡萄糖的細(xì)菌，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。34三糖鐵(TSI)試驗(yàn)測(cè)定細(xì)菌對(duì)葡萄糖、乳糖、蔗糖的分解和產(chǎn)硫化氫情況:不分解乳糖、蔗糖，分解葡萄糖√√不產(chǎn)酸，堿性粉紅色（-）；產(chǎn)酸黃色（+）；產(chǎn)生H2S黑色（+）；不產(chǎn)生H2S（-）

。思考題1.志賀菌屬都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多數(shù)不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)生硫化氫，應(yīng)該是幾號(hào)？2.大腸桿菌，能分解葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)能分解乳糖，不產(chǎn)生硫化氫，應(yīng)該是幾號(hào)管？3.沙門氏菌能分解葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，大多數(shù)產(chǎn)生硫化氫，多說產(chǎn)氣，應(yīng)該是幾號(hào)管？賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶使氨基酸脫羧生成胺和二氧化碳。胺使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，可用指示劑指示出來。

(2)方法：將待檢菌分別接種于1支賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)管和1支對(duì)照管，各覆蓋至少0.5cm高度的無菌石蠟油，35℃孵育1~4d，觀察結(jié)果。(3)結(jié)果：若為溴甲酚紫指示劑，陽性試驗(yàn)管培養(yǎng)初期（10—12h）因發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸變黃，繼續(xù)培養(yǎng)由于氨基酸脫羧產(chǎn)生胺類而使培養(yǎng)基由酸變堿，故又由黃變?yōu)樽仙ｊ幮栽囼?yàn)管則始終呈黃色。對(duì)照管應(yīng)為黃色。383進(jìn)一步生化試驗(yàn)：接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí)，接種蛋白胨水(供做靛基質(zhì)試驗(yàn))、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基各1管。于3