DNA加合物檢測技術(shù)

DNA加合物檢測技術(shù)和方法1、DNA加合物：一般是指外源或者內(nèi)源的親電性的化合物或其代謝產(chǎn)物與親核性的DNA大分子發(fā)生反應(yīng)而生成的共價加合物，是DNA損傷的一類重要形式。2、可與DNA發(fā)生加合作用的化學(xué)物質(zhì):烷化劑，多環(huán)芳烴，苯乙烯氧化物，醌類，醛類，抗腫瘤藥物，黃曲霉素，N-亞硝基化合物,雜環(huán)芳香胺和丙烯酰胺等。其中的一些化合物具有較強(qiáng)的親電性，可直接與DNA的堿基反應(yīng)生成加合物，如醛類化合物；另外一些化合物需要經(jīng)過體內(nèi)的代謝酶活化，產(chǎn)生具有親電性，活潑的代謝物，進(jìn)而與DNA的堿基反應(yīng)形成共價的復(fù)合物，即DNA加合物3、研究DNA加合物的意義：DNA加合物是一類極其重要的生物標(biāo)志物作為接觸（暴露）生物標(biāo)志物，反映致癌物到達(dá)靶位的實(shí)際接觸劑量，為監(jiān)測及分析致癌性化學(xué)污染物的暴露提供有效手段；作為一種效應(yīng)標(biāo)志物，反映DNA受到的損傷效應(yīng)，為生物體的癌癥風(fēng)險(xiǎn)評價提供重要信息。4、檢測DNA加合物的技術(shù)水平生物體內(nèi)DNA加合物的含量非常低，大約為每108個核苷酸中含有

0.1～1個加合物；要求所發(fā)展的DNA加合物檢測方法的靈敏度應(yīng)該在每108個核苷酸中能檢測出1個加合物的水平上。5、目前主要的DNA加合物檢測方法：32P-后標(biāo)記法免疫毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光法免疫分析法液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法毛細(xì)管電泳串聯(lián)質(zhì)譜法6、32P-后標(biāo)記法32P-后標(biāo)記法以其高靈敏度（1個加合物/109個核苷酸的水平），低樣品（1-10ug）用量且支持空白對照，不需事先制備加合物標(biāo)樣的優(yōu)點(diǎn)在DNA加合物的檢測中占據(jù)了重要地位。它不僅能檢測DNA加合物，還能檢測多種形式的DNA損傷，是目前應(yīng)用最為廣泛的DNA加合物檢測方法。6.1原理：(1)采用DNA水解酶將DNA降解為3’-磷酸單核苷酸;(2)在T4多核苷酸激酶的作用下將[γ-32P]ATP

上的32P標(biāo)記到單核苷酸的5’端,形成可放射顯影的5’-32PNp3’(正常單核酸)或5’-32PXNp-3’(含加合物的單核酸)(3)采用多維薄層色譜(TLC)或高效液相色譜(HPLC)分離正常的單核苷酸與含加合物的單核苷酸;(4)對分離得到的含加合物的單核苷酸通過放射自顯影技術(shù)制成指紋圖,液閃計(jì)數(shù)測定所含加合物的含量。6.2標(biāo)準(zhǔn)的32P-后標(biāo)記法基本步驟DNA加合物樣品的制備DNA加合物的提取和純化32P-后標(biāo)記過程加合物的分離與分辨自顯影和定量6.3標(biāo)準(zhǔn)的32P-后標(biāo)記法具體步驟6.3.1DNA加合物樣品的制備動物：用雌性大鼠(SD),采用腹腔注射的施藥方式,將有毒物溶液注入大鼠的腹腔中,24h后采集動物各組織樣品,迅速冷凍貯存于低溫冰箱中.人體：靜脈血樣，取待測人群中某時某人的靜脈血5ml(加抗凝劑)，盡快(24h之內(nèi))提取全血中的淋巴細(xì)胞(或白細(xì)胞),貯于一70℃的低溫冰箱內(nèi).6.3.2DNA加合物的提取和純化

動物組織

人血淋巴細(xì)胞

組織細(xì)胞勻漿

淋巴細(xì)胞勻漿加蛋白酶溫育45min(37℃)用Sevay(氯仿/異戊醇,V/V,24/1)溶劑提取三次依次用飽和酚、酚/Sevay(V/V:l/1)、Sevay(氯仿/異戊醇,24/1)提取水相用冷乙醇沉淀水相用冷乙醇沉淀用RNAse在37℃下培育1h將粗提的DNA用蛋白酶K培育lh,然后用RNAse酶培育1hDNA濃度用紫外分光光度計(jì)測量.6.3.332P-后標(biāo)記過程DNA和加合物,加一定量外切酶和內(nèi)切酶,在適量的酶解緩沖溶液存在下培育2-3h,使DNA完全酶解成2’-脫氧核苷3’-單磷酸(3’-dNmP+3’-dXmP)用適當(dāng)量的P1核酸酶37℃培育40min,以除掉大量正常DNA的酶解物在T4多核苷酸激酶的催化下,γ-32PATP(uCi)和底物(2’-脫氧核苷3’-單磷酸)反應(yīng)(37℃,30min),生成帶放射磷的2’-脫氧核苷3’5’二磷酸酯(3’5’dNDP+3’5’dXDP)最后加1ul的腺苷三磷酸酶37℃下培育30min,除掉多余的放射磷.6.3.4加合物的分離和分辨依據(jù)DNA和DNA加合物的酶解物色譜性能的差異標(biāo)記過的DNA加合物的酶解物樣品點(diǎn)在ODS一TLC吸附板上(10×10cm)用相應(yīng)的展開劑展開,分離加合物與正常核酸將留在ODS板上的加合物接觸轉(zhuǎn)移到PEI一TLC陰離子交換板上,用不同的展開劑多次多相的展開,將不同的加合物分離分辨開.6.3.5自顯影和定量將展好的PEI板進(jìn)行自顯影處理,制出DNA加合物的自顯影指紋圖.然后將相應(yīng)的PEI板上的多余斑點(diǎn)(與空白對照)取下,液閃計(jì)數(shù)定量計(jì)算,加合物含量用RAL(相對加合物標(biāo)記率)表示:DNA加合物的自顯影指紋圖6.432P-后標(biāo)記法的不足DNA需要經(jīng)過酶解，操作麻煩，定量準(zhǔn)確度差不同種類、不同結(jié)構(gòu)的加合物的標(biāo)記效率不一樣依賴各種色譜法進(jìn)行分離，分離過程漫長，工作量大，自動化程度低檢測的特異性低，難以區(qū)分結(jié)構(gòu)類似的DNA加合物6.532P-后標(biāo)記法的改良方法6.5.1限量ATP法

在標(biāo)記反應(yīng)中限制加入ATP的量，由于被加合物的核苷酸優(yōu)于正常的核苷酸，從而提高了靈敏度。（107-108單核苷酸）6.5.2丁醇富集法

在將DNA樣品消化成3’-單核苷酸后，加入丁醇及反相試劑四丁基氯化銨，在酸性的條件下將抽提富集的被加合核苷，然后再進(jìn)行標(biāo)記。6.5.3

核酸酶P1/S1富集法

在進(jìn)行32P標(biāo)記反應(yīng)前，用核酸酶P1或S1處理3’單核苷酸，正常3’-單核苷酸可以被核酸酶P1去磷酸化,從而不被T4多聚核苷酸激酶作用,而核酸酶P1不能使加合的核苷酸去磷酸化,這樣在進(jìn)行標(biāo)記時就只有加合的核苷酸被標(biāo)記上32