細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作指南

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作指南目 錄洗滌與滅菌細(xì)胞培育瓶小燒杯、吹管鹽水瓶瓶蓋、膠塞塑料器皿附注：洗液配方〔次強(qiáng)酸液〕配置常用溶液平衡鹽溶液pH調(diào)整液抗生素液2.3.1青霉素+鏈霉素2.3.2兩性霉素2.3.3G4182.3.4潮霉素2.4消化液2.5培育基2.5.1配置2.5.2使用培育操作根本要求無菌操作一．洗滌與滅菌在組織培育中，離體細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都格外敏感。有害物質(zhì)包括微生物、細(xì)胞剩余物以及非養(yǎng)分成分的化學(xué)物質(zhì)。因此對(duì)承受和重使用的培育器皿，都要嚴(yán)格清洗。細(xì)胞培育瓶：浸泡：璃器皿，玻面常帶有很多枯槁的灰塵，同時(shí)在生產(chǎn)過程中，玻璃外表常呈堿性并帶有一些對(duì)(5%)浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。培育后的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)，枯槁后不易刷洗掉，故用后要馬上浸入清水中；留意讓水能完全進(jìn)入瓶皿中，不應(yīng)留有氣泡。刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般仍舊要用毛刷沾洗滌劑洗滌，以除去器皿外表的附著較牢的雜質(zhì)。刷洗次數(shù)太多，能損害器皿外表光澤度，所以應(yīng)選用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)的洗滌劑〔如高級(jí)洗衣粉或洗潔精，確定不能使用含沙粒的去污粉！洗刷時(shí)特別留意洗刷瓶角部位?？梢詫⑾礈靹┑谷虢菖嘤康那逅校苯釉谒羞M(jìn)展刷洗，然后再以清水沖洗干凈。泡酸：器皿無腐蝕作用，去污力量很強(qiáng)，是清洗過程中關(guān)鍵的一環(huán)。浸泡時(shí)，器皿要布滿洗液，勿留氣泡。浸泡時(shí)間不應(yīng)少于6小時(shí)，一般應(yīng)浸泡過夜。留意，泡酸時(shí)要戴防酸手套，否則將損傷皮膚。沖洗：泡酸后必需用水充分沖洗，使之不留任何殘跡。沖洗時(shí)每瓶都要用水灌滿，倒掉。沖洗程2010遍，最終用雙蒸水沖洗兩遍。干烤：以鋁鉑封好瓶口，放入烘烤罐中，1602小時(shí)，完成干熱滅菌方能使用。返回名目小燒杯、吹管：(1)浸泡：初次使用和培育用后的小燒杯、吹管一樣需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶解掉。的玻璃器皿，同培育瓶一樣用鹽酸浸泡。泡酸：〔依據(jù)狀況可省略這一步〕刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗燒杯壁，吹管內(nèi)壁也可用極細(xì)的軟毛刷刷洗。沖洗：104遍，最終用雙蒸水沖洗兩遍。干烤：蓋上筒蓋，1602小時(shí)，完成干熱滅菌方能使用。鹽水瓶：鹽水瓶主要用于放置培育基、Versen、D-Hanks等，一般購自醫(yī)院，原來已經(jīng)盛放過溶液，為保證使用液的純潔，應(yīng)充分洗滌、滅菌。用過的鹽水瓶先要裝滿水，以防內(nèi)壁上的附著物枯槁；使用前倒去內(nèi)容水，以洗液浸泡過夜，然后沖洗，自來水2010遍，雙蒸2遍，再以鋁鉑包裹瓶口，外包報(bào)紙，1602小時(shí)，完成干熱滅菌備用。瓶蓋、膠塞：2%NaOH10~201%30分鐘，最終104次，晾干，以紙包好，濕熱滅菌備用。塑料器皿：目前我試驗(yàn)室組織培育使用的塑料器皿主要是從國外購置的，是一種無毒并已經(jīng)輻照滅菌、密封包裝的商品。用時(shí)，只要翻開包裝即可，是一次使用性物品。必要時(shí)，用后經(jīng)過無菌處理后，尚可反復(fù)使用2~3次，但不宜過多。再用時(shí)仍舊需要清洗和滅菌處理。塑料器皿質(zhì)地軟，不宜用毛刷刷洗，造成清洗困難。為此使用中一是防止劃痕，二是用后要馬上浸入水中嚴(yán)防附著物枯槁；如殘留有附著物，可在洗液中浸泡過夜，用流水沖洗干凈，再用蒸餾2小時(shí)以上，置無菌處〔如超凈臺(tái)〕備用。凍存管可不必用紫外線滅菌，泡酸、清洗干凈后，旋上管蓋〔留意不要旋緊裹后裝入飯盒中濕熱滅菌備用。附注：洗液配方〔次強(qiáng)酸液〕重鉻酸鉀 120g濃硫酸 200mL蒸餾水 1000mL配置時(shí)先將濃硫酸倒入蒸餾水中，邊加邊攪拌，再將重鉻酸鉀晶體溶解入。返回名目二．配置溶液全部細(xì)胞培育用液都必需以三蒸水配置，在本試驗(yàn)室的條件下以雙蒸水配置。平衡鹽溶液：PBS

(g/L)

D-HanksKCl 0.2

KClKHPOKHPO

0.2 2 42 4 NaClNaCl 8.0 NaHCONaHPO·12H0

2.08

3NaHPO·12H02 4 2

2 4 2酚 紅(g/L)0.40.068.00.350.080.0210×濃度的儲(chǔ)存液，在儲(chǔ)存液內(nèi)加少許氯仿〔2-3mL〕防腐；氯仿在高壓滅菌時(shí)可揮發(fā)掉，不影響使用；加氯仿后要用力混勻，在室溫或4℃儲(chǔ)存。用時(shí)按比例稀釋，塞上膠塞，膠塞上插(g/L)0.40.068.00.350.080.02pH調(diào)整液：HEPES〔238.31〕200mL47.6HEPES1NNaOHpH7.5~8.04℃1M抗生素液：培育基液內(nèi)參加適量的抗生素，以預(yù)防由于操作不慎而產(chǎn)生的微生物污染。常用的1100×的儲(chǔ)藏液，-20℃保存。青霉素+鏈霉素：取注射用青霉素鈉鹽粉末和注射用硫酸鏈霉素粉末，依據(jù)1萬單位每毫升的比例用D-Hanks100×的儲(chǔ)藏液，-20℃保存。兩性霉素：15mgB50mLD-Hanks100×的儲(chǔ)藏液，-20℃保存。留意由于兩性霉素非水溶性，儲(chǔ)藏液是渾濁的，稀釋使用時(shí)可恢復(fù)澄清。〔3〕G418：G418neo1G4181mL1MHEPES10mL，過濾消毒，4℃保存?！?〕潮霉素：用于轉(zhuǎn)染帶有hyg基因的載體質(zhì)粒后陽性克隆的篩選。購置的潮霉素B原液為14.82mg/mL2615mg/mL，4℃保存。消化液：Versen：即EDTA溶液，對(duì)細(xì)胞有肯定的離解作用，并且毒性小，價(jià)格低廉，使用便利。配1000mLD-Hanks0.2gEDTA，高壓滅菌即可，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｒ鹊鞍酌溉芤骸睺rypsi：胰蛋白酶主要來自?；蜇i的胰臟，是一種黃白色粉末，易潮解，應(yīng)放置冷暗枯燥處保存，本試驗(yàn)室保存于-200.25克置燒杯中，先用少100mL，NaHCO3pH至7.244℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｆ渲饕饔檬鞘辜?xì)胞相互離散。胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的分別作用與細(xì)胞的類型和細(xì)胞的特征有親熱的關(guān)系，不同的細(xì)胞系對(duì)胰蛋白酶溶液的濃度、溫度和作用時(shí)間等的要求也不一樣。一般來講，濃度大、溫度高、作用時(shí)間越長，對(duì)細(xì)胞的分別力量也越大，但超過肯定的限度也會(huì)損傷細(xì)胞。對(duì)不同的細(xì)胞系要進(jìn)展梯度嘗試。培育基：細(xì)胞在體外的生存環(huán)境是人工模擬的，除需無菌、溫度、空氣等條件外，最主要的是培育基。它是供給細(xì)胞養(yǎng)分和保證細(xì)胞生長增殖的物質(zhì)，細(xì)胞生長在培育基中，故培育基也是細(xì)胞的生存環(huán)境。培育基的種類很多，按其性質(zhì)狀態(tài)，分半固體培育基〔如軟瓊脂培育基〕和液體培育基。液體培育基是最主要的，按其來源，則分自然培育基和合GIBCOHyClone配置〔1〕DMEM：哺乳動(dòng)物細(xì)胞培育基，每包干粉可以配置1950mL3.7gNaHCO3pH到7〔用1NNaOH或1NHCl，邊攪拌邊參加，直至適宜的pH值，加蒸餾水補(bǔ)充體積到1〔1mL〕25mL37℃恒溫箱中放置一星期，其余4℃保存。確定37℃中的培育基未長菌后，保存的培育基才可以使用?！?〕RPMI1640：1950mL2gNaHCO3pH7.0〔1NNaOH1NHCl，pH1〔約1mL〕置25mL培育瓶中，將培育瓶在37℃恒溫箱中放置一星期，其余4℃保存。確定37℃中的培育基未長菌后，保存的培育基才可以使用?！?〕Grace”s：1950mL3.3g3.3gpH6.0(用1NNaOH或1NHCl，邊攪拌邊參加，直至適宜的pH值，加蒸餾水補(bǔ)充體積到1升，過濾除菌，取出小量〔約1mL〕25mL培育瓶中，將培育瓶在37℃恒溫箱中放置一星期，4℃37℃中的培育基未長菌后，保存的培育基才可以使用。使用配置完全培育基合成培育基〔無血清培育基，serumfreemedium，SFM〕使用前應(yīng)參加血清，以供給足夠的養(yǎng)分。細(xì)胞培育用血清常用的有胎牛血清〔fetalbovineserum,FBS〕和小牛血清(calfserum/bovineserum,CS/BS)，假設(shè)針對(duì)培育細(xì)胞的物種來源選擇同種動(dòng)物的血清對(duì)細(xì)胞更有利，但由于價(jià)格、個(gè)體差異、易污染等緣由而不行能。使用進(jìn)口的胎牛血清可以保證無支原體的污染，且小牛血清中可能含有哺乳后生物活性物質(zhì)的污染，質(zhì)量不如胎牛血清，因此本試驗(yàn)室目前根本上使用胎牛血清。參加血清的濃度依試驗(yàn)要5%-20%10%的，為掌握細(xì)胞的生長速度，可以降低血清的濃度到5%，細(xì)胞生長狀況不佳時(shí)可以將血清濃度提高到15%，20%血清濃度的培育基一般只在轉(zhuǎn)染時(shí)使用。菌，可以不加抗生素，不過在當(dāng)前試驗(yàn)條件下還是提倡參加抗生素),參加抗生素的比例1:100，100mL1mL100×)。一般一次配置適量的完全培育基(50-100mL)，以減小和避開由可能發(fā)生的污染而引起的損失。附注：常用抗生素用量和效應(yīng)抗生素使用濃度作用對(duì)象G100U/ml革蘭氏陽性菌鏈霉素100μg/ml革蘭氏陰性菌B3μg/ml局部革蘭氏陽性菌、霉菌完全培育基配方〔50mL，10%血清：無血清培育基 45mL血清 5mL青霉素G+鏈霉素 0.5ml兩性霉素B 0.5ml配制前先取出-20℃56℃30min〔熱滅〕化凍后再開紫外燈滅菌，做操作前的預(yù)備工作。血清和培育基應(yīng)避開紫外線的過多照耀，以免輻射造成成分的轉(zhuǎn)變。配制時(shí)取一較大容積的無菌燒杯，先倒入約一半體積的無血清培育基，參加足量4℃保存?zhèn)溆?。培育基的選擇不同的細(xì)胞系有各自最適合的培育基，選擇培育基可通過閱歷和試驗(yàn)來確定。本試驗(yàn)室常用的特定細(xì)胞的培育基細(xì)胞系 培育基Hela RPMI1640DMEMHepG2 DMEMJC RPMI1640NIH3T3 DMEMCHO RPMI1640對(duì)于不生疏的細(xì)胞系，可以用不同的培育基同時(shí)進(jìn)展培育，看哪種最適于細(xì)胞的生長。最終固定下來。三．培育操作根本要求1．：防止污染是打算培育是否成功的首要條件，由于體外培育細(xì)胞缺乏抗感染力量，故在安全牢靠。培育前預(yù)備：操作開頭前應(yīng)清點(diǎn)所需的全部用品，并放置于操作場地，然后進(jìn)展消毒，一方面可以的時(shí)機(jī)。操作前翻開紫外燈對(duì)操作野進(jìn)展消毒。用3030分鐘以上，但時(shí)間置，否則物品相互遮擋射線，會(huì)降低消毒效果。利用超凈工作臺(tái)操作時(shí)，由于整個(gè)前臂要伸入臺(tái)內(nèi)，可先清洗手部和肘部，再以75%酒精棉球擦拭消毒，然后進(jìn)展操作。假設(shè)在無菌室內(nèi)進(jìn)展操作，要穿消毒的衣帽，戴口罩和手套進(jìn)展。在無菌環(huán)境進(jìn)展培育或做其他無菌操作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈，以后一切操作，如安裝吸管帽、啟開或封閉瓶口等，都需經(jīng)過火焰燒灼進(jìn)展。留意：燒灼不行過頭，以免消滅碳化、變形等現(xiàn)象，玻璃用品可燒灼2-3分鐘，塑料用96%的不含雜質(zhì)的酒精。培育操作：進(jìn)展培育操作時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確快速，但又不必太快，以防空氣流淌增加污染時(shí)機(jī)。盡量不要用手觸及已消毒的器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒觸及部，或取性，一般先將D-Hanks、Versen等倒入小燒杯中，再取細(xì)胞培育瓶以燒杯中的液體進(jìn)展操作，用過后馬上蓋上。吸取不同的液體要使用不同的吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或面發(fā)生污染。操作后整理操作完畢后應(yīng)清理超凈臺(tái)，將臺(tái)面上剩余的液體擦干，廢棄物取出，培育基、胰酶等放回1/3凈臺(tái)、培育間開紫外燈滅菌半小時(shí)以削減污染。四．復(fù)蘇細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇要遵循慢凍快融的原則，即冷凍的速度慢而溶解的速度快，以避開冰晶的形成損壞細(xì)胞。預(yù)備較干凈的熱水浴〔自來水或蒸餾水，水溫37℃-42℃。復(fù)蘇哺乳動(dòng)物細(xì)胞選擇42℃37400ml3/4插入溫度計(jì)，以便隨時(shí)觀看水溫。在電爐上將水燒至適宜的溫度〔可略高一、兩度，以防降溫，再移至液氮罐旁。確定所需復(fù)蘇的細(xì)胞在凍存盒中的位置，快速取出投入熱水浴中，反復(fù)搖動(dòng)細(xì)胞凍存管使〔戴手套操作以防凍傷〕翻開液氮罐取出裝有凍存盒的支架的動(dòng)作要慢，支架向液氮罐內(nèi)傾斜，使掛在支架上的液氮流回液氮罐，削減鋪張。但應(yīng)盡量削減凍存盒在空氣中暴露的時(shí)間，以削減溫度的變化。取出熱水浴中的凍存管，以酒精棉球消毒外部。在無菌環(huán)境下吸出凍存管中的液體移入預(yù)備4mL50mL12小時(shí)后大局部細(xì)胞都已貼壁，傾倒去舊的培育基〔含有DMSO，會(huì)影響細(xì)胞生長5mL五．換液細(xì)胞在生長的過程中會(huì)消耗培育基中的養(yǎng)分成分并把代謝產(chǎn)物釋放到培育基中去。呼吸放出的二氧化碳將使培育基變黃，假設(shè)細(xì)胞數(shù)量尚未到達(dá)傳代的程度〔鋪滿70%以上的培育瓶底可傳代，這時(shí)必需進(jìn)展換液。倒出舊的培育基，換上等量培育基即可。以免濺起其它廢液造成污染。六．細(xì)胞傳代細(xì)胞生長至貼滿90%〔一般三到四天乃至死亡〔細(xì)胞變圓、收縮，細(xì)胞內(nèi)顆粒明顯，細(xì)胞貼壁不牢，培育基顏色變黃等。為保證細(xì)胞的狀態(tài)良好，可以在細(xì)胞生長到對(duì)數(shù)生長中期，即70%滿瓶時(shí)就進(jìn)展傳代。(1)觀看：當(dāng)觀看到細(xì)胞生長到對(duì)數(shù)生長中期，70-80%滿瓶，同時(shí)細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)即可傳代。留意在進(jìn)入細(xì)胞間觀看前，至少要開半小時(shí)的紫外，但時(shí)間也不行過長，以免臭氧通過換氣進(jìn)入培育箱影響細(xì)胞生長。進(jìn)入前，須先清洗干凈手部和肘部，再以75%酒精棉球擦拭消毒后(不得偷懶)再進(jìn)展觀看。*CO2

培育箱時(shí)，要?jiǎng)幼骺焖贉?zhǔn)確，以免CO2

泄漏過多。取出培育瓶時(shí)，不要遺忘要快速擰緊培育瓶蓋。*在顯微鏡下觀看時(shí)，為了要觀看貼壁細(xì)胞，必需將培育瓶倒置，在倒置時(shí)要留意動(dòng)作不要過大，留神盡量不要讓培育基流到瓶口部位。*CO2

培育箱時(shí)，不要遺忘將瓶口擰松后再放回。預(yù)備：在觀看完細(xì)胞后，假設(shè)打算要做傳代，則要將傳代所需要的培育基、胰酶等從冰箱取出放于培育間內(nèi)待用，并需留意在超凈工作臺(tái)內(nèi)是否有足量的D-Hanks、Versen液，如不夠也必需從冰箱中取出儲(chǔ)藏液預(yù)備補(bǔ)加，取出后也先置于培育間內(nèi)待用。細(xì)胞間及超凈工作臺(tái)紫外照耀至少半小時(shí)。傳代:在進(jìn)入細(xì)胞培育間進(jìn)展操作前，請(qǐng)務(wù)必按前面所寫的要求進(jìn)展消毒處理。同時(shí)為了您的安康也請(qǐng)別遺忘，在進(jìn)入細(xì)胞間內(nèi)操作時(shí)要關(guān)了紫外燈再進(jìn)去。*留意在消毒了雙手和肘部進(jìn)入細(xì)胞操作間之后，請(qǐng)勿再接觸其它未消毒的物品。*在關(guān)閉超凈工作臺(tái)的紫外，翻開有機(jī)玻璃擋板后，請(qǐng)先點(diǎn)燃酒精燈再做其它操作。從筒中用止血鉗取出一枝滅菌過的玻璃吹管，先將吸頭部位在火上燒灼，再套上橡皮膠頭，之后再將玻璃吹管的其它局部在火上過幾遍，尤其是手曾接觸過的局部。消毒后先放置一旁待用。200uL200uL的槍頭，置于一旁待用〔用于一會(huì)吸取胰酶。CO2

培育箱，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將舊培育基倒入廢液缸，先倒入適量〔約4ml〕D-Hank`s液洗一下，再倒去D-Hank`s液，參加適量〔約1.5ml〕Versen液，假設(shè)需用胰酶消化，則可再用槍參加200uL胰酶，輕輕混勻后，平置消化。最好記時(shí)，一般五分鐘左右即適宜。當(dāng)細(xì)胞形態(tài)收縮趨圓，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞相互分別時(shí)即可終止消化。將消化液留神倒入廢液缸，再參加適量的培育基，用吹管留神將細(xì)胞從壁上吹下，并吹勻后再進(jìn)展分裝一般可一瓶細(xì)胞可傳為二或三瓶)，分裝好的各瓶要補(bǔ)足培育基，再取滅菌后的蓋子蓋嚴(yán)，放回CO2

培育箱，固然在放入前要將蓋子擰松。對(duì)于半貼壁細(xì)胞，如H9101，不必使用消化液，D-Hanks沖洗一遍后，直接參加培育基，以吹管將細(xì)胞從壁上吹下，吹勻、分裝即可。昆蟲細(xì)胞 SF9也是半貼壁細(xì)胞，傳代時(shí)只需傾去舊的培育基，參加的培育基，以吹管將細(xì)胞從壁上吹下，吹勻、分裝即可。收尾:4℃，同時(shí)將超凈工作臺(tái)和細(xì)胞間內(nèi)整理干凈，假設(shè)廢液缸已滿，請(qǐng)將其取出洗凈，滅菌后再放回細(xì)胞間內(nèi)。當(dāng)操作完從細(xì)胞間出來后，最好翻開紫外再消毒一段時(shí)間(<0.5hr)。最終別遺忘關(guān)紫外燈。七．細(xì)胞保種要長期保存某一細(xì)胞系，維持其良好的性狀，在進(jìn)展了15-20次傳代后應(yīng)準(zhǔn)時(shí)進(jìn)展保種，將細(xì)胞凍存于液氮中。保種用液可以是完全培育基，也可以是全血清。目前本試驗(yàn)室一般承受完全培育基保種，SF9用全血清保種較好。為避開冰晶形成損傷細(xì)胞，應(yīng)參加占總體積10%的DMSO?！睤MSO有弱毒性，盡量不要接觸到皮膚〕(1)2-3天的細(xì)胞，察，細(xì)胞貼壁結(jié)實(shí)、均勻，折光度小，較透亮，細(xì)胞器不明顯，死細(xì)胞及其它雜質(zhì)少。(2)消化：將用于保種的細(xì)胞取出CO2培育箱，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將舊培育基倒入廢液缸，先倒D-Hank`s液洗一下，再倒去D-Hank`s液，參加適量的Versen液，假設(shè)需用胰酶消化，則可再用槍參加200uL胰酶，輕輕混勻后，平置消化。最好記時(shí)，一般五分鐘左右即適宜。當(dāng)細(xì)胞形態(tài)收縮趨圓，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞相互分別時(shí)即可終止消化。將消化液留神〔2ml后，放置一邊。分裝：目前使用的細(xì)胞凍存管有1ml、2ml兩種規(guī)格，已經(jīng)過輻照滅菌，密封包裝，存放于培育間內(nèi)。用時(shí)將止血鉗過火滅菌，從外包裝袋中取出所需數(shù)量的凍存管，用手捏住凍存管的下部，以止血鉗翻開管蓋，蓋里朝上置于臺(tái)面上，并將凍存管直立于臺(tái)面上，酒精燈四周。將已經(jīng)消化下的細(xì)胞再次吹吸混勻，吸滿一吹管后逐滴滴入敞口的凍存管內(nèi)，同時(shí)記數(shù)。以一滴液體50μl記，1.5ml的凍存管內(nèi)應(yīng)滴入18滴細(xì)胞懸液，2ml凍存管內(nèi)應(yīng)滴入36滴細(xì)胞懸液。取200μl加樣器，吸取DMSO再次參加凍存管內(nèi)，1.5ml的凍存管內(nèi)應(yīng)參加100μlDMSO，2ml凍存管內(nèi)應(yīng)參加200μlDMSO；也可用吹管吸取DMSO，逐滴滴入凍存管內(nèi)，1.5ml的凍存管內(nèi)滴入2滴DMSO，2ml4滴DMSO，使DMSO的終濃度到達(dá)10%。1~2次，使液體混〔〕凍存將處理好的凍存管置于-20存盒中置于液氮液相中長期凍存。存放液氮?dú)庀鄷r(shí)可以用紗布制作一小布袋，內(nèi)放凍存管，袋口栓上細(xì)繩，垂放入液氮罐中，當(dāng)袋底部接觸液氮液相時(shí)，會(huì)發(fā)出較大的液體飛濺的聲音，這時(shí)將布袋略提高一點(diǎn)就是適宜的存放位置。將凍存管轉(zhuǎn)移到凍存盒中的動(dòng)作要快，以免操作中溫度上升。但翻開液氮罐取出裝有凍存盒的支架的動(dòng)作要慢，支架向液氮罐內(nèi)傾斜，使掛在支架上的液氮流回液氮罐，削減鋪張?？梢詢扇藚f(xié)作操作，先翻開凍存盒，再快速取出布袋內(nèi)的凍存管放入盒內(nèi)。記清所存放的細(xì)胞的準(zhǔn)確位置，凍存后記錄清楚〔細(xì)胞種類、存放液體、凍存時(shí)間，保存人〕以備日后查尋。戴手套操作以防凍傷。八．哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞在培育基中生長至鋪滿70％細(xì)胞培育瓶底。D-Hanks洗一次，再用Versen5min。Versen3mL完全培育基終止反響，用吹管吹打細(xì)胞使之懸浮，吸15μl〔細(xì)胞數(shù)/mL原液＝計(jì)數(shù)板上4角大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000×稀釋倍數(shù)〕依據(jù)細(xì)胞濃度吸取10－20萬細(xì)胞至六孔板〔φ＝35mm〕中，每孔加完全培育基補(bǔ)2mL。37℃，5％CO培育箱培育24hr。2混勻脂質(zhì)體和待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒〔每孔細(xì)胞按以下量加樣〕solutionA:吸取大提質(zhì)粒2μg〔加TE補(bǔ)至總體積400μl40μl41000μl無水乙醇，混勻，液氮中放3min，12023rpm離心10min將上清傾干，沉淀在超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干，以100μl無血清培育基溶解。solutionB: lipofectAMINE2－25μl，加無血清培育基補(bǔ)至100μl。solutionA，B，在室溫下放置15－45min。吸去六孔板中的培育基，以2mL無血清培育基洗滌細(xì)胞一次。往solutionA，B混合液中參加800μl無血清培育基，混勻，加于六孔板的裸細(xì)胞上，37℃CO培育箱25hr。往各孔中參加含正常量2倍血清的培育基〔不加抗生素〕。在開頭轉(zhuǎn)染后18－24hr，吸去六孔板中的混合液，參加2mL完全培育基培育。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后觀看并檢測培育上清。SF9轉(zhuǎn)染細(xì)胞在培育基中生長至鋪滿70％細(xì)胞培育瓶底。傾去舊培育基，參加約3mL完全培育基，用吹管吹打細(xì)胞使之懸浮，吸15μl至細(xì)〔細(xì)胞數(shù)/mL原液＝計(jì)數(shù)板上4/4×10000×稀釋倍數(shù)〕依據(jù)細(xì)胞濃度吸取10－20萬細(xì)胞至六孔板〔φ＝35mm〕中，每孔加完全培育基補(bǔ)2mL。27℃恒溫箱中培育2~6小時(shí)?；靹蛑|(zhì)體和待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒〔每孔細(xì)胞按以下量加樣〕solutionA: 吸取bacmid2μg加無血清培育基補(bǔ)充到100μl。solutionB: 吸取Cellfectine2－25μl，加無血清培育基補(bǔ)至100μl。solutionA，B，在室溫下放置15－45min〔一般選擇30min〕吸去六孔板中的培育基，以2mL無血清培育基洗滌細(xì)胞一次。往solutionA，B混合液中參加800μl無血清培育基，混勻，加于六孔板的裸細(xì)胞上，27℃恒溫箱中孵5小時(shí)。吸去六孔板中的混合液，參加2mL完全培育基培育。⑺轉(zhuǎn)染18小時(shí)后觀看并檢測培育上清?！?〕轉(zhuǎn)染72細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，可以2023轉(zhuǎn)離心2分鐘，無菌狀態(tài)下吸取上清，4℃避光保存。附1：Bacmid將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TSS致敏緩沖液制備的E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，該細(xì)胞含有穿梭質(zhì)粒Bacmid和關(guān)心質(zhì)粒，關(guān)心質(zhì)?？梢詭椭D(zhuǎn)移質(zhì)粒pFB載體上轉(zhuǎn)座子內(nèi)側(cè)的外源基因轉(zhuǎn)移到Bacmid8μl質(zhì)粒參加到100μl30min，再往轉(zhuǎn)化管中參加900μlLB〔留意不要做熱休克〕，37℃100rpm/min搖培4h后轉(zhuǎn)移質(zhì)粒在Bacmid的LacZ編碼區(qū)，并使DH10Bac獲得慶大霉素抗性。將搖培后的菌液倍比稀釋〔1：10〕，各取200μl均勻涂布在含有X-galIPTG、慶大霉素、卡那霉素和四環(huán)素的LB平板上，37℃倒置培育24hr以上，觀看菌落的密度和白色菌落的數(shù)量，選擇一個(gè)平板上均勻長有200多個(gè)菌落的，以無菌牙簽挑取白色的單菌落，挑入含三種同樣抗性的液體LB培育基中，37℃震蕩培育過夜，堿法小量提取重組病毒DNA〔bacmid〕。收集3ml菌液中的菌體，按堿法小量提取質(zhì)粒的步驟參加溶液一、二、三，但將用量分別提高到200μl、400μl和300μl。冰水浴5min后12023rpm離心10min，吸取上清，用等體積氯仿抽提二次，留意參加氯仿后不行用力震蕩，蓋緊管蓋后反復(fù)輕柔顛倒，直至水相和有機(jī)相〔有時(shí)還會(huì)消滅白色的蛋白抽提物eppendorf4℃放置10min，12023rpm離心10min，沉淀即bacmid。70%乙醇洗滌沉淀一次，用移液器盡量吸干管內(nèi)附著的液體，放開eppendorf管，在超凈臺(tái)內(nèi)吹干〔約需半小時(shí)〕，參加40μl無菌TE或水，65℃放置10min使之溶解完全，可用于轉(zhuǎn)染。留意，提取的bacmid4℃-20℃保存的bacmid在凍融后簡潔斷裂，影響轉(zhuǎn)染效率，因此不宜在-20℃保存。附2：DH10Bac選擇培育基抗生素含量50μg/ml kanamycin〔卡那霉素〕7μg/ml Gentamicin〔慶大霉素〕10μg/ml Tetracycline〔四環(huán)素〕100μg/mlX-gal&40μg/ml為了節(jié)約X-gal和IPTG的用量，在鋪固體培育基平板時(shí)不參加這兩種物質(zhì)，而是在涂布平板前半小時(shí)，以200μlLB培育基稀釋40μlX-gal〔母液濃度100μg/ml〕和6.7μlIPTG〔母液濃度500μg/ml〕，37℃恒溫箱，待溶液被吸取后，再涂布轉(zhuǎn)化的菌液。細(xì)胞計(jì)數(shù)用血球計(jì)數(shù)板做細(xì)胞計(jì)數(shù)〔見圖〕。依據(jù)狀況用養(yǎng)分液稀釋與否均可，如先稀釋，計(jì)算時(shí)20μl細(xì)胞懸液，從計(jì)數(shù)板邊緣輕輕滴入，使懸液自由布滿蓋玻片下方間隙，勿留氣泡。蓋玻片與血球計(jì)數(shù)板之間大約可容納10μl的液體，多余的會(huì)自動(dòng)流出蓋玻片外。稍候片刻，顯微鏡下觀看并計(jì)算出四角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)〔圖中藍(lán)色的局部〕；壓線者只計(jì)上線和右線的細(xì)胞，然后按下式計(jì)算出細(xì)胞濃度：〔四大格中細(xì)胞總數(shù)/4〕×10000×稀釋倍數(shù)=細(xì)胞數(shù)/毫升原液留意：1〕細(xì)胞懸浮后應(yīng)用吹管輕輕反復(fù)吹打片刻，以使細(xì)胞充分散開，如計(jì)算時(shí)仍見有團(tuán)塊，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算,如細(xì)胞團(tuán)數(shù)占10%以上，說明消化不充分，或細(xì)胞數(shù)少于200個(gè)/10平方毫米或多于500個(gè)/10平方毫米時(shí)，均說明稀釋不當(dāng)，需重制備細(xì)胞懸液，再重計(jì)數(shù)；2〕取樣前仍需用吹管稍吹打，以防細(xì)胞沉降，另外向計(jì)數(shù)板滴入懸液量不能過多，致使蓋玻片漂移；或過少易有氣泡?！?.0mm|←1.0mm→←1.0mm→||←1.0mm→|1.0mm→←1.0mm|→深0.1mm |血球計(jì)數(shù)板十．軟瓊脂試驗(yàn)〔soft-agarcolony〕細(xì)胞和惡性細(xì)胞卻無大影響。瓊脂的這種選擇性作用，一是很多細(xì)胞難以貼附，二是其中含有抑制的多聚陰離子，不利正常的細(xì)胞生長。瓊脂經(jīng)降低毒性處理，特別是削減多聚陰離子后的產(chǎn)物即為瓊脂糖〔Agarose〕。瓊脂糖可用作克隆不能在瓊脂中生長〔因毒性〕的貼附依靠性細(xì)胞。試驗(yàn)證明，惡變細(xì)胞或惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞在軟瓊脂〔1.2%〕中的生長與在裸鼠體上的致瘤性有很大的全都性。因此測試細(xì)胞能否在軟瓊脂中生長，已成為測試轉(zhuǎn)化細(xì)胞惡性性的重要指標(biāo)，用以測定轉(zhuǎn)化后的克隆形成率。具體做法如下：試劑及材料的預(yù)備：5×培育基：取一包培育基干粉〔1000ml用量〕以200ml雙蒸水溶解，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。瓊脂糖溶液：在兩個(gè)100ml鹽水瓶中以雙蒸水分別配置兩種濃度的瓊脂糖溶液，鋁鉑封口，再分別放入兩個(gè)盛有一半水的大燒杯中，報(bào)紙封口，扎緊后高壓滅菌，隨后馬上放入45℃水浴中，保持其液體狀態(tài)。a.0.72%agar0.25gagar+34.5mlddH2Ob.0.5%agar0.15gagar+29.5mlddH2O5mleppendorf管，1ml、200μl槍頭。操作步驟：在5mleppondorf管中混勻1ml 5×培育基〔37℃預(yù)熱〕500μl 血清3.5ml0.72%agar〔45℃預(yù)熱〕50μl 100×抗生素馬上參加35mm平皿中，每皿1ml，凝固后成為下層基質(zhì)。在5mleppondorf管中混勻1ml 5×培育基〔37℃預(yù)熱〕500μl 血清3ml0.5% agar〔45℃預(yù)熱〕臨時(shí)置于37℃。將待檢測的細(xì)胞消化下來，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度到略大于100萬個(gè)/毫升，取500μl與B液混勻，以每皿1ml的量參加到已鋪有A瓊脂層的平皿中，室溫下待其凝固。平皿放置于二氧化碳培育箱內(nèi)培育2Gimsa染色，拍照。大于10個(gè)細(xì)胞的集落算做一個(gè)克隆，依據(jù)克隆的數(shù)量確定細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的效率。十一．細(xì)胞單克隆的分別哺乳動(dòng)物細(xì)胞單克隆株分別：72hrVerson50mL玻璃培育瓶中培育，待細(xì)胞生長至根本貼壁時(shí)再參加含作用濃度為400ug/mLG4182～3G4182～3將已形成細(xì)胞克隆的培育瓶置于顯微鏡下，觀看克隆的位置，并用記號(hào)筆將其標(biāo)出。(3)Verson5～20s后取出在加有完全培育基(600uL/孔)的24孔板中刷洗數(shù)次，將附著上的細(xì)胞洗下。245%CO37℃進(jìn)展培育。22480ELISA測。將經(jīng)檢測可表達(dá)目的基因的細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)入50mL螺口培育瓶中連續(xù)培育，并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候進(jìn)展傳代換液，擴(kuò)增細(xì)胞，進(jìn)展進(jìn)一步的鑒定。淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)一、細(xì)胞融合前預(yù)備(一)免疫方案選擇適宜的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb前兩個(gè)月左右確立免疫方案開頭初次免疫，免疫方案應(yīng)依據(jù)抗原的特性不同而定。顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:初次免疫 1×10７／0.5mlip(腹腔內(nèi)注射)↓2～3其次次免疫 1×10７／0.5mlip↓3加強(qiáng)免疫(融合前三天)1×10７／0.5mlip或iv(↓取脾融合可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上集中呈小滴狀說明已到達(dá)油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。初次免疫 Ag1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射│ 0.8～1ml0.2ml／點(diǎn))↓3其次次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip│ (ip0.5ml)↓3第三次免疫劑量同上，不加佐劑，ip│(5～7↓2～3加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg，ip或iv取脾融合目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更，如①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增加了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②轉(zhuǎn)變抗原注入的途徑，根底免疫可直接承受脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)抗原反響性。(二)飼養(yǎng)細(xì)胞在制備單克隆抗體過程中，很多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培育過程中，參加飼養(yǎng)細(xì)胞是格外必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(較為常用)、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備小鼠承受與免疫小鼠一樣的品系，常用BaLb／c14-16↓拉頸處死浸泡于753～5↓用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜↓用無菌注射器注入6～8ml↓反復(fù)沖洗，吸出沖洗液↓10ml，12005～6↓20％小牛血清(NCS)(FCS)1×10５／ml↓96，100μl／孔↓37℃CO2

孵箱培育一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細(xì)胞.(三)骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量 McAb。SP20、NS1X63Ag8.653等。骨髓瘤細(xì)胞的培育適合于一般的培育液，如DMEM培育基。小牛血清的濃度一般在10～20％，細(xì)胞的最大密度不得超10６／ml1∶103～5倍增時(shí)間為16～20小時(shí)，上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或稍微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。一般在預(yù)備融合前的兩周就應(yīng)開頭復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，為確保該細(xì)胞對(duì)HAT性，每3～6月應(yīng)用8～AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細(xì)胞的突變。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95％，也是打算細(xì)胞融合的關(guān)鍵。(四)免疫脾細(xì)胞免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時(shí)B液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培育液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的２倍，細(xì)胞數(shù)為２×10８左右。(一)細(xì)胞融合流程取對(duì)數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞SP20，1000rpm5細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培育液洗滌2同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培育液洗滌2將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶101∶550ml1，1200rpm,8分鐘。棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。在室溫下融合:①301ml45％PEG(SIGMA,1500),90120PEG1ml2ml3ml4ml，5ml10ml離心，800rpm，66ml20DMEM在一起的細(xì)胞散開。9610ml96將融合后細(xì)胞懸液參加含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96100μl／孔，37℃、5％CO孵箱培育。2961×107脾細(xì)胞。(二)HAT24HAT選擇培育液。HT和HAT50×貯存，用時(shí)1ml50ml20200μl／孔。所以在加選擇培育液時(shí)應(yīng)加3倍量的HAT2／350×HATH:5×10-3MA:2×10-5MT:8×10-4MHATHT液。篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇性培育而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1／10瘤細(xì)胞系。檢測抗體的方法應(yīng)依據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有:ELISAMcAbRIAMcAbFACS(McAbIFAMcAb牢靠的篩選方法必需在融合前建立，避開由于方法不當(dāng)貽誤整個(gè)篩選時(shí)機(jī)?？寺』话闶侵笇⒖贵w陽性孔進(jìn)展克隆化。犚rHAT個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞；所需要的抗體(特異性抗體)分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對(duì)于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)展克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，由于抗體非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞喪失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體喪失，從而喪失產(chǎn)生抗體的力量。(一)克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。有限稀釋法的程序①制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液(同融合前預(yù)備)②陽性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1～5×10３／ml③取1306.5ml20ml，100μl／孔加AB、C22.9ml2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培育液,細(xì)胞數(shù)為10個(gè)／ml，100μl／孔加D、E、F12.2ml2.2ml細(xì)胞的完全培育液，細(xì)胞數(shù)5／ml，100μl／孔，加G、H0.54～5200μl／孔。8～9注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培育液中加HT。軟瓊脂法①軟瓊脂的配制20％FCS(2DMEM1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。0.5111202DMEM42℃保溫。②用上述0.5)15ml9cm后作為基底層備用。100／ml，500／ml5000／ml④1ml0.5(42℃1ml⑤混勻后馬上傾注于瓊脂基底層上，在室溫中1037℃，5％CO2孵箱中。⑥4～57～1024培育。⑦檢測抗體，擴(kuò)大培育，必要時(shí)再克隆化。(二)雜交瘤細(xì)胞的凍存準(zhǔn)時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是格外重要的。由于在沒有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培育過程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體力量的喪失等等。假設(shè)沒有原始細(xì)胞的凍存，則由于上述的意外而全功盡棄。雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以24一孔就可以凍一支安瓿。細(xì)胞凍存液:50％小