液相色譜分析課件

現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)

液相色譜分析技術(shù)高效液相色譜技術(shù)離子色譜技術(shù)色譜法的歷史20世紀(jì)初色譜法誕生20世紀(jì)40年代建立了色譜基礎(chǔ)理論20世紀(jì)50年代生產(chǎn)第一臺(tái)商品氣相色譜儀20世紀(jì)60年代高效液相色譜20世紀(jì)70年代離子色譜誕生20世紀(jì)80年代毛細(xì)管電泳色譜高效液相色譜法分類

液固吸附色譜法

吸附解吸液液分配色譜法溶解揮發(fā)

—化學(xué)鍵合相色譜法離子色譜法

離子交換能力凝膠色譜法以分子尺寸的差異進(jìn)行分離

—凝膠過濾色譜

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凝膠滲透色譜親和色譜法親合力（用于細(xì)胞內(nèi)容物，培養(yǎng)基或血漿中的純化核酸、蛋白，抗體的分離，溫度4度吸附，25度洗脫）化學(xué)鍵合相色譜法

鍵合相色譜法可分為正相色譜法和反相色譜法。正相色譜：固定相為極性，流動(dòng)相為非極性。

官能團(tuán)為－CN氰基、－NH2氨基等。流動(dòng)相強(qiáng)度：正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇反相色譜：固定相為非極性，流動(dòng)相為極性。官能團(tuán)為烷烴如：C18(ODS)、C8、C4用的最多，約占60～70％。流動(dòng)相強(qiáng)度：H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃色譜柱固定相的影響色譜柱粒徑的影響溶劑選擇及梯度設(shè)置WaterMethanolEthanolIsopropanolAcetonitrileTHFHexaneIsooctaneN-PentaneElutionstrengthincreasesforreversedphase100%ACN90%ACN/10%H2O80%ACN/20%H2O凝膠過濾色譜法（GFC）

-尺寸排阻色譜

應(yīng)用于水溶液中多肽、蛋白質(zhì)、多糖的分析，測(cè)定分子量的分布。適用于對(duì)未知樣品的分析，可以很快提供樣品分子量大小組成的全面概況，迅速判斷樣品是簡(jiǎn)單的還是復(fù)雜的混合物，常常是對(duì)復(fù)雜的未知樣品進(jìn)行分析的關(guān)鍵一步。全滲透排斥選擇滲透V0

VcVM空間排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，或用來分析大分子物質(zhì)的相對(duì)分子量分布?？臻g排阻色譜的特點(diǎn)：保留時(shí)間是分子尺寸大小的函數(shù)。保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)。固定相與分子間作用力弱，柱壽命長(zhǎng)。不能分辨分子大小相近的化合物。高效液相色譜儀高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)記錄系統(tǒng)WATERS公司HPLC儀WATERS公司HPLC儀

日本島津公司高效液相色譜儀LC－10A

Waters高效液相色譜和超高效液相色譜液相色譜—流動(dòng)相單一溶劑：甲醇、乙腈、四氫呋喃、MTBE等或水?；旌先軇?種以上混合溶劑，如甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸緩沖溶液、己烷-乙酸乙酯等。等強(qiáng)度洗脫：流動(dòng)相組成和流量保持恒定。液相色譜—流動(dòng)相梯度洗脫：流動(dòng)相組成比列和流量隨時(shí)間變化。需要比例閥、閥驅(qū)動(dòng)器、溶劑比例控制器、梯度程序器。注意：1、溶劑需要帶蓋密封；2、溶劑需要脫氣處理：攪拌下真空抽氣或通入惰性氣體（氦、氮）驅(qū)走其中的溶解氣體。液相色譜—高壓泵

有往復(fù)泵、注射泵、氣體放大泵等，不銹鋼材質(zhì)，主要是要能克服大阻力以恒定流速輸送流動(dòng)相。最大輸出壓力為：30000～50000kPa輸出流量有較大調(diào)節(jié)范圍：分析型0.1~10mL/min；制備型50～100mL/min。要求輸出流量精度高、穩(wěn)定性高。液相色譜—高壓泵

目前多用柱塞往復(fù)泵。流量不受柱阻影響，調(diào)節(jié)沖程及頻率即可調(diào)節(jié)流量，死體積小，容易清洗及更換流動(dòng)相，適于梯度洗脫；輸液有脈沖波動(dòng)，對(duì)示差折光檢測(cè)器產(chǎn)生基線噪聲而影響靈敏度。脈沖阻尼器消除輸出脈沖。towastePurgevalveABCD比例閥四元梯度泵--低壓混合二元梯度泵--高壓混合AB液相色譜—進(jìn)樣閥進(jìn)樣閥是保證色譜分析準(zhǔn)確度的重要部件。

六通手動(dòng)進(jìn)樣閥：羅達(dá)因（Rheodyne）進(jìn)樣閥：兩個(gè)位置，一是取樣，二是進(jìn)樣。有固定體積的進(jìn)樣定量環(huán)管，0.5-100ul之間，可根據(jù)樣品情況更換選用。

自動(dòng)進(jìn)樣器：模擬手動(dòng)進(jìn)樣過程。

注意：1、進(jìn)樣閥內(nèi)部通道很細(xì)，不能帶有固體顆粒，所以水樣需要用濾膜過濾(0.45umor0.2um)；2、樣品濃度不能太高，以免在進(jìn)樣閥內(nèi)析出結(jié)晶；3、經(jīng)常清洗進(jìn)樣閥通道。

液相色譜—進(jìn)樣閥自動(dòng)進(jìn)樣器液相色譜—自動(dòng)進(jìn)樣樣品架不銹鋼材質(zhì)、有柱管、接頭和過濾片，柱管內(nèi)填充幾微米的小顆粒填料即固定相（當(dāng)前仍以硅膠基質(zhì)的填料占主導(dǎo)地位）。內(nèi)徑通常4-8mm、也有1-2mm的細(xì)管徑分析柱，還有1mm以下的毛細(xì)管分析柱。液相色譜—色譜柱

液相色譜—色譜柱

紫外檢測(cè)器-紫外吸收檢測(cè)器是一種選擇性濃度型檢測(cè)器，僅對(duì)在紫外波長(zhǎng)下有吸收的物質(zhì)響應(yīng).靈敏度高、噪生低，應(yīng)用廣（70%）示差折光檢測(cè)器-是一種通用性檢測(cè)器，只要組分折光率與流動(dòng)相折光率不同，就能進(jìn)行檢測(cè)檢測(cè)的化合物范圍廣，特別在尺寸排阻色譜中多用靈敏度低，折光率隨環(huán)境溫度變化大，不能用于梯度洗脫熒光檢測(cè)器－是最靈敏的高效液相色譜檢測(cè)器，屬于選擇性濃度型檢測(cè)器靈敏度比紫外吸收檢測(cè)器高約2個(gè)數(shù)量級(jí)，特別適合于痕量分析非熒光物質(zhì)可通過熒光試劑反應(yīng)變成熒光物質(zhì)后檢測(cè)，擴(kuò)大了檢測(cè)器應(yīng)用范圍二極管陣列一種光學(xué)多通道檢測(cè)器。在晶體硅上緊密排列一系列光電二極管，每一個(gè)二極管相當(dāng)于一個(gè)單色器的出口狹縫，二極管越多分辨率越高，一般是一個(gè)二極管對(duì)應(yīng)接受光譜上一個(gè)納米譜帶寬的單色光。高效液相色譜儀的檢測(cè)器高效液相色譜法的應(yīng)用生物工程中——氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、核苷酸、核酸醫(yī)藥研究中——解熱鎮(zhèn)痛類藥物、磺胺類藥、抗菌素類合成藥物的純化質(zhì)量控制、中草藥的分析分離制備提純、手性藥物的分離分析，約80％的藥物可以用HPLC進(jìn)行分析分離。食品分析中——食品本身營(yíng)養(yǎng)成分如糖類、有機(jī)酸、維生素、蛋白質(zhì)、脂肪，食品添加劑如防腐劑、抗氧化劑、合成色素、甜味劑、保鮮化學(xué)物質(zhì)，食品污染物如農(nóng)藥殘留、黃曲霉素的分析。環(huán)境工程中——多環(huán)芳烴、農(nóng)藥殘留、酚類、胺類、陰離子和非離子表面活性劑。精細(xì)化工——脂肪族或芳香族的醇、醛、酮、醚、酸、酯、表面活性劑、聚合物、藥物、染料、炸藥等化工產(chǎn)品

離子色譜技術(shù)離子色譜法作為高效液相色譜的一個(gè)分支，在無機(jī)陰離子分析方面占有很大優(yōu)勢(shì)。離子色譜的分類離子交換色譜(HPIC)－離子交換離子排斥色譜(HPICE)－離子排斥離子對(duì)色譜(MPIC)－吸附和離子對(duì)的形成柱填料多為苯乙烯－二乙烯基苯的共聚物固定相是離子交換樹脂離子交換樹脂又分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。用于有機(jī)無機(jī)陰離子分離的陰離子交換樹脂的功能基為季胺基用于陽離子分離的陽離子交換樹脂的功能基為磺酸基和羧酸基。離子交換色譜抑制電導(dǎo)的基本原理離子排斥色譜分離機(jī)理包括Donnan排斥，空間排阻、吸附固定相為高容量的總體磺化的苯乙烯－二乙烯基苯的共聚物用于有機(jī)酸、無機(jī)弱酸和醇類的分離強(qiáng)酸不被保留離子對(duì)色譜固定相是弱極性和高比表面積的中性多孔聚苯乙烯二乙烯基苯樹脂和弱極性的辛烷或十八烷基鍵合的硅膠。流動(dòng)相是在去離子水中添加有機(jī)改進(jìn)劑和離子對(duì)試劑（烷基磺酸、季胺化合物）用于分析陰陽離子表面活性劑、無機(jī)陰離子離子色譜的優(yōu)點(diǎn)離子色譜法是進(jìn)行離子測(cè)定的快速、靈敏、選擇性好的方法，它可以同時(shí)檢測(cè)多種離子，樣品處理簡(jiǎn)單，分離柱穩(wěn)定性好，廢液無污染或少污染.

對(duì)陰離子的測(cè)定更是其他方法所不能相比的。如果說高頻感應(yīng)等離子光譜是同時(shí)測(cè)定多種元素的快速、準(zhǔn)確的分析方法，那么，同時(shí)測(cè)定多種陰離子的快速、靈敏的方法便是離子色譜法了。