第三章核酸化學(xué)

第三章核酸化學(xué)1第一節(jié)概述一、核酸的概念及重要性核酸是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，是生物體中重要遺傳物質(zhì)。（攜帶和傳遞遺傳信息）22.核酸的發(fā)現(xiàn)和研究工作進(jìn)展1868年FridrichMiescher從膿細(xì)胞中提取“核素”1944年Avery等人證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)1953年Watson和Crick發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)1965年Nirenberg發(fā)現(xiàn)遺傳密碼1970年Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶1981年Gilbert和Sanger建立DNA測序方法1985年Mullis發(fā)明PCR技術(shù)1990年美國啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃(HGP)1994年中國人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)2001年美、英等國完成人類基因組計(jì)劃基本框架3二、核酸的分類及生物學(xué)作用1.脫氧核糖核酸（DNA）：90%以上分布于細(xì)胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體，質(zhì)粒等。攜帶遺傳信息，決定細(xì)胞和個(gè)體的遺傳型。2.核糖核酸（RNA）:存在于胞核、胞液和線粒體,參與遺傳信息的復(fù)制與表達(dá)。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體.4第二節(jié)核酸分子的基本組成單位－單核苷酸核酸的化學(xué)組成1.元素組成C、H、O、N、P（9~10%）2.分子組成堿基(base)：嘌呤堿，嘧啶堿戊糖(ribose)：核糖，脫氧核糖磷酸(phosphate)5一、核酸的組成成分堿基戊糖磷酸核苷酸核苷核酸6核苷酸的結(jié)構(gòu)

嘌呤嘧啶堿基腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（U）DNA有RNA有每種核酸都含有四種堿基。7

嘌呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌呤(guanine,G)堿基8嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)9

堿基的互變異構(gòu)酮式－烯醇C=OC-OHNN氨基－亞氨基C-NH2C=NH2+

+HNHN

受介質(zhì)pH影響10戊糖（構(gòu)成RNA）1′2′3′4′5′核糖(ribose)（構(gòu)成DNA）脫氧核糖(deoxyribose)H11磷酸

OOO‖‖解離 ‖HO—P—OHHO—P——P—O－|||OHOHO－磷酸磷?；?2核苷：AR,GR,UR,CR脫氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR二、核苷1.核苷(ribonucleoside)的形成堿基和核糖（脫氧核糖）通過糖苷鍵連接形成核苷（脫氧核苷）。1′113核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脫氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

三、核苷酸核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。

14電腦模型圖簡化式酯鍵糖苷鍵15四、核苷酸的其衍生物含核苷酸的生物活性物質(zhì)：NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD等都含有AMP

多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP環(huán)化核苷酸:cAMP，cGMPAMPADPATPcAMPNADP+NAD+16多磷酸核苷酸

常見的核苷酸為一磷酸單核苷酸，如5′—AMP。一磷酸核苷酸可與一分子磷酸結(jié)合成二磷酸核苷酸，如ADP；二磷酸核苷酸再與一分子磷酸結(jié)合成三磷酸核苷酸，如ATP。ADPATP即為多磷酸核苷酸。17重要生理功能：①參與能量代謝。ATP是能量通貨；②各種三磷酸核苷酸參與DNA、RAN的生物合成（作原料）；③參與其它合成。如UTP參加糖轉(zhuǎn)化、合成，CTP參與嘌呤、蛋白質(zhì)的合成；④作輔酶的結(jié)構(gòu)成分。如NAD+、NADP+。18環(huán)化核苷酸

1950年EarlSutherland（薩瑟蘭德）在激素研究中偶爾發(fā)現(xiàn)腺苷3′，5′—一磷酸，即cAMP充當(dāng)了激素第二信使的作用，并放大了激素信號(hào)。另外cGMP，有人認(rèn)為它與cAMP的作用相拮抗。19第三節(jié)核酸的基本結(jié)構(gòu)－多核苷酸一、核苷酸的連接方式核苷酸之間以磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。聚合酶催化細(xì)胞中的RNA和DNA的合成。通過催化一個(gè)核苷酸的核糖或脫氧核糖第5′位的磷酸，與另一個(gè)核苷酸的第3′位的羥基之間脫水縮合形成3′，5′-磷酸二酯鍵，并釋放出無機(jī)焦磷酸。多個(gè)核苷酸以3′，5′-磷酸二酯鍵連接成線形大分子，即多核苷酸鏈。20215′端3′端核苷酸之間以3,5-磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。CGA22書寫方法23二、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)定義核酸中核苷酸的排列順序。由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列24AGP5PTPGPCPTPOH3書寫方法5pApCpTpGpCpT-OH

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ACTGCT

3目錄25

DNA與RNA的區(qū)別核酸堿基戊糖DNAA、G、C、T脫氧核糖RNAA、G、C、U核糖26第四節(jié)DNA的空間結(jié)構(gòu)DNA的空間結(jié)構(gòu)是指多核苷酸鏈與多核苷酸鏈之間通過氫鍵及堿基堆積力，在空間形成的螺旋、卷曲和折疊的構(gòu)象。DNA的空間結(jié)構(gòu)包括DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)。27一、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)一般是指DNA分子的空間雙螺旋結(jié)構(gòu)。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立，揭開了現(xiàn)代分子生物學(xué)的序幕。1953年Watson和Crick總結(jié)前人的研究成果，提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。28DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)29DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)想（1）DNA分子是由兩條互相平行、但走向相反（一條鏈為3‘→5’，另一條鏈為5‘→3’）的脫氧多核苷酸鏈組成，兩條鏈以右手螺旋方式平行地圍繞同一個(gè)軸盤旋成雙螺旋結(jié)構(gòu)（2）雙螺旋的兩條主鏈都是由脫氧核糖酸殘基中的糖和磷酸構(gòu)成的，是雙螺旋的骨架。兩條鏈上的堿基兩兩成對(duì)層疊分布于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，堿基平面與螺旋軸垂直。雙螺旋的直徑為2nm，螺旋每繞一圈升高3.4nm，含10個(gè)堿基對(duì)30（3）兩鏈之間的堿基是通過氫鍵相連形成堿基對(duì)，并且堿基配對(duì)有一定規(guī)律，即A與T通過形成兩個(gè)氫鍵配對(duì)（A=T）；G與C通過形成三個(gè)氫鍵配對(duì)（G≡C）。因此，有4種可能的堿基對(duì)，即A－T、T－A、G－C和C－G。在堿基對(duì)之中的兩個(gè)堿基稱為互補(bǔ)堿基，由于DNA雙鏈同一水平上的堿基對(duì)都是互補(bǔ)的，所以兩條鏈也是互補(bǔ)的，稱為互補(bǔ)鏈，只要知道一條鏈的堿基排列順序，就能確定另一條鏈的堿基排列順序。DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)的生物合成都是通過堿基互補(bǔ)原則實(shí)現(xiàn)的，堿基互補(bǔ)規(guī)律有重要的生物學(xué)意義。31

DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)總結(jié)DNA分子由兩條脫氧核糖核酸作骨架的雙鏈組成，以右手螺旋方式盤旋糖－磷酸骨架均位于外側(cè)，堿基在內(nèi)側(cè)堿基平面之間距離為0.34nm。螺旋一周為10堿基對(duì)，螺距為3.4nm。雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠捶较蚱叫械?。堿基配對(duì)：G=CA=T。穩(wěn)定力：互補(bǔ)堿基之間的氫鍵疏水性堆積力-堿基堆積力32維持雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素兩條鏈堿基之間的氫鍵（離子鍵、范德華力）堿基之間的堆積力：作用最大環(huán)境中的正離子33DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)3435堿基配對(duì)及氫鍵形成36DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)雙螺旋DNA進(jìn)一步扭曲盤繞則形成其三級(jí)結(jié)構(gòu)，超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式。許多病毒DNA、細(xì)菌質(zhì)粒DNA和真核生物的線粒體DNA以及葉綠體DNA，多是由雙螺旋結(jié)構(gòu)的首尾兩端接成環(huán)狀。雙螺旋進(jìn)一步發(fā)生扭曲形成超螺旋結(jié)構(gòu)。37DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞核染色質(zhì)中DNA雙螺旋纏繞在組蛋白的八聚體上，形成核小體。許多核小體之間由DNA鏈相連，形成串珠狀結(jié)構(gòu)。在串珠狀結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，再經(jīng)過幾個(gè)層次折疊，將DNA緊密壓縮于染色體中。細(xì)胞內(nèi)的DNA主要以超螺旋形式存在，比如，人的DNA在染色體中的超螺旋結(jié)構(gòu)，使DNA分子反復(fù)折疊盤繞后共壓縮8400倍左右。38DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)真核生物中DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)有關(guān)。和DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)有組蛋白和非組蛋白。組蛋白H2A、H2B、H3和H4各兩個(gè)分子形成八聚體，被兩圈140-145堿基對(duì)的DNA所圍繞。形成核小體。H1位于核小體之間的連接區(qū)，組成串珠狀結(jié)構(gòu)。39DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)超螺旋40DNA超螺旋結(jié)構(gòu)核小體示意圖41DNA的功能基因：就是DNA大分子的一個(gè)片段，有復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等主要功能，是生物遺傳繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。DNA的功能：是儲(chǔ)存遺傳信息，保證每一種生物機(jī)體合成它們獨(dú)特的蛋白質(zhì)和RNA，使機(jī)體按一定時(shí)間和空間順序來合成細(xì)胞成分,作為生物遺傳信息復(fù)制的模版和基因轉(zhuǎn)錄的模版。一個(gè)生物體的全部基因序列稱為基因組。42生物體內(nèi)DNA的大小43第五節(jié)RNA的空間結(jié)構(gòu)RNA由一條多核苷酸鏈組成，經(jīng)卷曲盤繞可形成局部雙螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)RNA通常以單鏈形式存在，但也可形成局部的雙螺旋結(jié)構(gòu)。RNA分子的種類較多，分子大小變化較大，功能多樣化。44動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)主要RNA的種類及功能45轉(zhuǎn)運(yùn)tRNA、核糖體rRNA及信使mRNA

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在RNA分子的多核苷酸鏈中也能形成與DNA相類似的螺旋區(qū)，這是由單鏈自身回折，使鏈內(nèi)可配對(duì)的堿基（A-U,G－G）相遇形成氫鍵（A－U堿基對(duì)），使該部分扭轉(zhuǎn)形成螺旋。但其螺旋結(jié)構(gòu)與DNA的略有不同，堿基既不彼此平行，也不垂直于螺旋的軸。這是因?yàn)樵诤颂堑?‘位置上多出的氧原子的大部分伸入到結(jié)構(gòu)的密集部位所致。46tRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)tRNA分子中含有較多的稀有堿基：DHU、ψ和mG、mA等所有的tRNA均是線性多核苷酸鏈，局部片斷由于堿基互補(bǔ)而形成局部雙螺旋區(qū)，而非互補(bǔ)區(qū)則形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。整個(gè)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)三葉草結(jié)構(gòu)tRNA中的3個(gè)環(huán)分別是DHU環(huán)、TψC環(huán)和反密碼環(huán)tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)倒L型，一端為氨基酸臂，另一端為反密碼子47tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)—三葉草型結(jié)構(gòu)五部分：氨基酸接受臂二氫尿嘧啶環(huán)反密碼環(huán)額外環(huán)：之間差異較大，是分類的指標(biāo)。TψCG

環(huán)48tRNA三葉草模型tRNA倒L形三級(jí)結(jié)構(gòu)49二、RNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸接受臂與反密碼子環(huán)分別位于兩端；分子上有兩個(gè)雙螺旋區(qū)；構(gòu)象靠非螺旋區(qū)的堿基之間的氫鍵維持。50tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)均呈倒L字母形，其3’末端含CAA-OH的氨基酸臂位于一端，反密碼環(huán)位于另一端。tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定力是核苷酸之間的各種氫鍵。51tRNA的功能tRNA活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯攜帶蛋白質(zhì)合成所需的氨基酸，并找mRNA上的密碼順序“對(duì)號(hào)入座”地將其轉(zhuǎn)運(yùn)到mRNA分子上。52tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

均為倒L型53第六節(jié)核酸的理化性質(zhì)及分離提純核酸（DNA和RNA）是大分子化合物，且都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑。RNA和核苷酸的純品都是白色粉末或結(jié)晶，DNA是白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸和鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。54一、核酸的理化性質(zhì)(一)核酸的分子大小1.核酸是分子量很大的高分子化合物。2.高分子溶液比普通溶液黏度要大得多，由于DNA分子極為細(xì)長，因此即使是極稀的溶液也有極大的黏度，RNA的黏度要小得多55（二）核酸的酸堿性質(zhì)1.核酸和蛋白質(zhì)一樣，也是兩性電解質(zhì)，在溶液中發(fā)生兩性電離。因磷酸基的酸性比堿基的堿性強(qiáng)，故其等電點(diǎn)偏于酸性。2.利用核酸的兩性解離能進(jìn)行電泳，3.核酸中的酸性基團(tuán)可與K+、Na+、Ca2+、Mg2+等金屬離子結(jié)合成鹽。4.當(dāng)向核酸溶液中加入適當(dāng)鹽溶液后，其金屬離子即可將負(fù)離子中和。5.DNA雙螺旋兩條鏈間堿基的解離狀態(tài)與溶液pH有關(guān)，溶液的pH將直接影響堿基對(duì)之間氫鍵的穩(wěn)定性，在pH4.0～11.0之間DNA最為穩(wěn)定56（三）核酸的紫外吸收特性

1、在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨(dú)特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。2、以A260/A280進(jìn)行定性、定量3、DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發(fā)出熒光5758（四）核酸的變性1、穩(wěn)定核酸雙螺旋次級(jí)鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。2、變性表征生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)）3、變性因素pH（>11.3或<5.0）；變性劑（脲、甲酰胺、甲醛）；低離子強(qiáng)度；加熱59（五）核酸的復(fù)性與雜交1、復(fù)性：因變性而解開的兩條單鏈，在溫度緩慢下降時(shí)重又聚合成雙鏈結(jié)構(gòu)的過程，復(fù)性在實(shí)驗(yàn)技術(shù)