液相色譜培訓(xùn)ppt

高效液相色譜培訓(xùn)

基本原理和特點液相色譜儀器部件實驗操作與應(yīng)用基本原理和特點

基本原理：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時,由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用(吸附,分配,離子吸引,排阻,親和)的大小,強(qiáng)弱不同,在固定相中滯留時間不同,從而先后從固定相中流出.特點：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動化。島津液相色譜儀結(jié)構(gòu)主泵副泵進(jìn)樣口柱溫箱檢測器流動相啟動液相色譜儀器的流程開啟HPLC系統(tǒng)各個設(shè)備的電源打開泵、檢測器電源，待設(shè)備通過自檢后，打開計算機(jī)啟動色譜管理軟件準(zhǔn)備流動相過濾，脫氣色譜泵排氣用新配制的流動相灌注泵高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)溶劑

色譜泵自動進(jìn)樣器

HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)液相色譜流程圖液相柱---保留值與pH的關(guān)系pH變化值0.1RS變化值1.6色譜柱：ZorbaxStableBondC18

4.6*250mm,5um流動相：27%甲醇：73%磷酸pH：2.5&2.6溫度：50℃流速：1.0mL/min.

流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分按極性分：極性、弱極性、非極性按使用方式分：等度洗脫和梯度洗脫

對溶劑的要求水：去離子水自動純水儀純凈水商品瓶裝水溶劑:

色譜純（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，異丙醇）試劑:分析純不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時間越短。理想的HPLC用水應(yīng)為18.2Ω的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、無機(jī)離子及空氣等。

過濾：0.45um或更小孔徑濾膜

目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡對測定的影響：

1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積

2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形

3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動

過濾與脫氣流動相的保存有機(jī)溶劑流動相：

室溫下密封，避光保存緩沖鹽流動相：

當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用：低溫下密封保存，一般不超過3天防止微生物生長有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相：低溫密封保存防止有機(jī)相的揮發(fā)選用適宜的容器液相色譜的色譜柱色譜柱的連接Stop_depth長度不合適造成柱前死體積錐箍錐度不合適造成滲漏色譜柱的連接除去柱上端固定相變色部分(約3mm左右)，再補(bǔ)充新的固定相。色譜柱吸附未被洗脫成分時，柱效將明顯下降，選合適的溶劑進(jìn)行洗凈。采用梯度洗脫時，柱在重復(fù)使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始溶劑壓經(jīng)柱子，以重新建立起始的平衡來得到再生?？赡芴岣咧У姆椒℉PLC檢測器應(yīng)提供的功能對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系理想的HPLC檢測器高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng)對壓力、溫度及流速等變化不敏感長時間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性靈敏度：信噪比靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測限（LOD）：S/N=2~4定量限（LOQ）：S/N=8~10好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認(rèn)更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性 6:1NS吸光度（AbsorbanceUV/Vis）檢測目前實驗室中最流行的選擇多數(shù)公司約75%的檢測器是吸光度檢測器（其中50%是多波長，25%是PDA）測量通過溶液后的紫外或可見光光強(qiáng)度的損失吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測物的最大吸收波長處檢測時靈敏度最大吸光度檢測器（UV/Vis）－優(yōu)點這種檢測器簡單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實驗并且是非破壞性的大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度一般來說靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabensat254nm吸光度檢測器（UV/Vis）－缺點由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測器對某些化合物的檢測靈敏度不及其他檢測器樣品中不同化合物的最大吸收波長不同時，需要使用多波長檢測，或使用折衷的波長受流動相組成的影響：用截止波長以上至少5～10nm作為工作波長緩沖鹽、離子對試劑、胺改性劑也會有影響溶劑混合的基線噪音色譜條件色譜柱：

C18,

5μm,3.9x150mmat35oC.流動相：

A:0.1%TFAinWater. B:0.1%TFAinAcetonitrile.梯度：5-40%Bin35min.流速：1.0mL/min.樣品：水（10μLinj.vol.）檢