第九章 凝膠過(guò)濾及

第九章凝膠過(guò)濾及離子交換層析介質(zhì)廣東省韶關(guān)學(xué)院生物科學(xué)系

第一節(jié)概述自茨維特1903年發(fā)明色譜法以來(lái)，該方法已經(jīng)廣泛用于生物分子的分析分離與制備。在蛋白質(zhì)、多糖、天然產(chǎn)物的分離純化與除熱源等方面得到了廣泛的應(yīng)用。其中的填料——色譜介質(zhì)，是決定色譜分離效果的主要、最重要的因素。目前，各個(gè)國(guó)家的許多公司，均有專門(mén)的色譜出售。有的用于分析效果好，有的適合大規(guī)模制備使用。60年代末，70年代初，高效液相色譜儀的研制成功，使色譜實(shí)現(xiàn)機(jī)械化、自動(dòng)化操作，提高了操作的復(fù)現(xiàn)性。這類全自動(dòng)的生產(chǎn)規(guī)模級(jí)的層析系統(tǒng)（如瑞典Pharmaciacom.的BioprocessⅠ、），能高速處理大量樣品，流速?gòu)?-20L/h到40-400L/h，能滿足各類規(guī)模生產(chǎn)的需要。他們的填料特點(diǎn)是：1、適用于實(shí)驗(yàn)室和大規(guī)模生產(chǎn)，重現(xiàn)性高。2、易清洗、消毒和再生，理化性質(zhì)穩(wěn)定，使用壽命長(zhǎng)。3、易裝柱，高工作容量，高流速，利于工業(yè)化生產(chǎn)。1975年Small提出了離子交換色譜法，1981年Jorgenson創(chuàng)立了毛細(xì)管電泳法。20世紀(jì)90年代后，出現(xiàn)的擴(kuò)張床吸附技術(shù)，通過(guò)一步純化，達(dá)到萃取、濃縮和初步純化的目的，所用的填料是STREAMLINE介質(zhì)——一種以Sepharose為基架的介質(zhì)。2004年GEHealthcare(原安瑪西亞公司)推出的新一代EBA擴(kuò)張柱STREAMLINEDirect柱，消除了樣品和氣泡容易堵在篩網(wǎng)下的問(wèn)題。各種用于大規(guī)模大分子分離純化生產(chǎn)的色譜方法見(jiàn)表9-1，需注意他們的分離原理、特點(diǎn)和應(yīng)用。類型機(jī)理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍離子交換靜電吸附操作簡(jiǎn)便，分辨率高，流速快，容量高易受離子干擾大量樣品處理凝膠過(guò)濾分子大小排阻效應(yīng)分辨力中等，不會(huì)引起變性，流速低，容量有限各種凝膠介質(zhì)昂貴，處理量有限制適合脫鹽，去熱源和純化的最后步驟疏水色譜疏水性分辨力高，重復(fù)性較好，體積不受限影響因子多適合純花的各個(gè)階段親和色譜生物大分子與配體之間有特殊親和力分辨力很高，流速快，容量大，體積不受限一種配體只能用于一種生物大分子適合純花的各個(gè)階段聚焦色譜等電點(diǎn)和離子交換作用分辨力高，流速快，容量大進(jìn)口試劑昂貴純化的后階段第二節(jié)凝膠過(guò)濾介質(zhì)一、凝膠過(guò)濾概念：又稱排阻層析或分子篩方法，是利用凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化的方法。凝膠過(guò)濾的優(yōu)點(diǎn)：①介質(zhì)穩(wěn)定，不帶電，不與溶質(zhì)反應(yīng)，蛋白質(zhì)不易變性。②適應(yīng)面廣，對(duì)各種大小的分子均適用。③設(shè)備簡(jiǎn)單，易操作，耗時(shí)少，可連續(xù)操作。常用于脫鹽和分級(jí)分離。分級(jí)分離是將分子大小相近的物質(zhì)分開(kāi)，且要選擇合適的凝膠，單次上樣量小，一般為床柱體積的5%-10%。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過(guò)單一凝膠床就可以完全將它們分開(kāi)二、凝膠介質(zhì)應(yīng)具備的條件優(yōu)良的凝膠介質(zhì)是獲得良好分離效果的前提，介質(zhì)必須：1、惰性材質(zhì)，不與溶質(zhì)和溶劑反應(yīng)。2、沒(méi)有或極少的非特異性吸附，提高回收率。消除帶電基團(tuán)。3、介質(zhì)內(nèi)孔徑大小分布均勻，孔徑分布要窄，才能保證分離效果好。4、凝膠珠大小均勻，均一性好。細(xì)粒填料能提高柱效。5、機(jī)械強(qiáng)度高，易于消毒，能反顧使用。三、凝膠介質(zhì)的種類主要為人工合成大分子和天然多糖類1、多糖類骨架這類多糖有纖維素、葡聚糖和瓊脂糖這類介質(zhì)生物相容性好，親水性強(qiáng)，不會(huì)導(dǎo)致生物分子變性失活。由瓊脂糖和葡聚聚合而成的糖新一代復(fù)合凝膠——Superdex高效過(guò)濾介質(zhì)，使生產(chǎn)效率進(jìn)一步提高，從小規(guī)模過(guò)濾延伸到大規(guī)模生產(chǎn)。2、合成大分子骨架介質(zhì)這類介質(zhì)有聚丙烯酰胺類、聚乙烯醇系和含羥甲基酰胺類等。克服了天然介質(zhì)易受微生物侵蝕的缺點(diǎn)，保留了多糖骨架親水的優(yōu)點(diǎn)。3、天然大分子與合成高聚物構(gòu)成混合骨架的介質(zhì)既親水抗微生物侵蝕，又有很好的生物相容性和剛性。凝膠層析分類

分類原則類型特征據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機(jī)理不同吸附色譜離子交換色譜疏水作用層金屬螯合色譜共價(jià)作用色譜分配色譜凝膠過(guò)濾親和色譜吸附力不同各物質(zhì)與固定相之間的離子交換能力的不同各物質(zhì)與固定相之間的疏水作用的強(qiáng)弱不同各物質(zhì)與固定相上的金屬離子的絡(luò)合能力的不同巰基化合物的巰基與固定相表面的二硫鍵作用力不同各物質(zhì)在兩液相間的分配系數(shù)不同各物質(zhì)的分子大小或形狀不同利用生物大分子與各種配基的生物識(shí)別能力不同據(jù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

低壓色譜中壓色譜高壓色譜電泳操作壓力小于0.5MPa操作壓力在0.5～5MPa之間操作壓力在5～40MPa之間溶質(zhì)分子在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同據(jù)固定相的形狀不同柱色譜紙色譜薄層色譜固定相裝在玻璃、不銹鋼或有機(jī)玻璃柱中固定相為以氫鍵與纖維素羥基結(jié)合的水固定相在玻璃平板上鋪成薄層據(jù)流動(dòng)相的物態(tài)不同

氣相色譜液相色譜超臨界流體色譜流動(dòng)相為氣體流動(dòng)相為液態(tài)流動(dòng)相為液態(tài)按操作方式不同

迎頭法頂替法洗脫法將混合物溶液連續(xù)通過(guò)固定相，只有化學(xué)親和力最弱的組分以純粹狀態(tài)最先流出，但其它各組分都不能達(dá)到分離。利用一種化學(xué)親和力比各被結(jié)合組分都強(qiáng)的物質(zhì)來(lái)洗脫，這種物質(zhì)稱為頂替劑。此法處理量大，且各組分分層清楚，但層與層相連，故不能將組分分離完全。將混合液盡量濃縮，使體積縮小，引入固定相的一端，然后用溶劑洗脫，洗脫溶劑可以是原來(lái)溶解混合物的溶劑，也可選用另外的溶劑。系列名稱

分離范圍

顆粒大小

應(yīng)用

Superdexprepgrade系列

Superdex30PG

小于10000

24~44微米

小肽

Superdex75PG

3000~70000

24~44微米

一般蛋白

Superdex200PG

10000~600000

24~44微米

單抗、大分子蛋白

Superose系列

Superose6PG

5000~5000000

20-40微米

蛋白、多糖、核酸、病毒

Superose12PG

1000~300000

20-40微米

蛋白、多糖、核酸

SephacrylHR系列

SephacrylS-100

1000~10000

25-75微米

肽類、小蛋白

SephacrylS-200

5000~250000

25-75微米

一般蛋白

SephacrylS-300

10000~1500000

25-75微米

抗體等較大蛋白

SephacrylS-400

~28000000

25-75微米

多糖、蛋白多糖、脂質(zhì)體

SephacrylS-500

~60000000

25-75微米

<1078bp的DNA片斷

SephacrylS-1000

~100000000

40-105微米

<20000bp的質(zhì)粒、巨大多糖、病毒

SepharoseFF系列

Sepharose6FF

10000~4000000

45~165微米

質(zhì)粒、病毒

Sepharose4FF

60000~20000000

45~165微米

病毒，rHBsAg等巨大分子

Sepharose

xB（CL-xB）系列

Sepharose2B

70000~40000000

60-200微米

大分子復(fù)合物

Sepharose4B

60000~20000000

45-165微米

病毒等大分子

Sepharose6B

10000~4000000

45-165微米

大分子SephadexLH系列

SephadexLH20

100-4000

30-100微米

天然產(chǎn)物

SephadexLH60

400-20000

40-120微米

天然產(chǎn)物

Sephadex系列

SephadexG-10

小于700

40-120

SephadexG-15

小于1500

40-120

SephadexG-25coarse

1000-5000

100-300

脫鹽及更換緩沖液用

SephadexG-25medium

1000-5000

50-150

SephadexG-25fine

1000-5000

20-80

SephadexG-25superfine

1000-5000

10-40

SephadexG-50coarse

1500-30000

100-300

小蛋白、多肽的分離

SephadexG-50medium

1500-30000

50-150

SephadexG-50fine

1500-30000

20-80

SephadexG-50superfine

1500-30000

10-40

SephadexG-75

3000-80000

40-120

一般蛋白的分離

SephadexG-75superfine

3000-70000

10-40

SephadexG-100

4000-150000

40-120

較大蛋白的分離SephadexG-100superfine

4000-100000

10-40SephadexG-150

5000-300000

40-120

大蛋白的分離SephadexG-150superfine

5000-150000

10-40SephadexG-200

5000-600000

40-120

大蛋白的分離SephadexG-200superfine

5000-250000

10-40

四、凝膠過(guò)濾注意事項(xiàng)凝膠過(guò)濾常用于下游產(chǎn)品最終純化步驟。填料選擇：根據(jù)樣品中組分情況，選擇分離范圍與分子量相近的介質(zhì)。組分多，大小分布廣的樣品應(yīng)選分離范圍廣的介質(zhì)；成分簡(jiǎn)單的樣品選擇分辨率高的凝膠。如需處理大量樣品，要選擇粒度較大，流速較快的介質(zhì)，要精細(xì)分離的，選粒度小分辨率高的介質(zhì)。裝柱：均勻攪拌一次倒入柱中，不能有氣泡和分層。為確保柱效，可用1%丙酮、蘭色葡聚糖等測(cè)定柱效。加樣：不能沖動(dòng)凝膠表層，每次控制樣品5%V。體積小分辨率高。為減少非特異性吸附，可在緩沖液中加一定濃度的鹽，0.1-0.2MNaCl。第三節(jié)凝膠過(guò)濾介質(zhì)的主要品種一、葡聚糖系列Sephadex1、結(jié)構(gòu)以氯代環(huán)氧丙烷進(jìn)行交聯(lián)的葡聚糖珠狀凝膠，孔徑大小取決交聯(lián)度。按孔徑不同形成G系列凝膠。葡聚糖結(jié)構(gòu)G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表持水量。X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。X數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。X數(shù)字也代表凝膠的持水量，如G-25表示1g干膠持水2.5mL，G-100表示1g干膠持水10mL，依次類推。2、性能①溶脹性能吸水膨脹，商品以干粉供應(yīng)。②化學(xué)穩(wěn)定性不溶于一切溶劑，在水、鹽、堿和弱酸中穩(wěn)定。③物理穩(wěn)定性pH近中性時(shí)耐高壓高溫，所以可以高壓滅菌。④機(jī)械強(qiáng)度各種G系列凝膠均有一定機(jī)械強(qiáng)度，能承受一定壓力，機(jī)械強(qiáng)度大小取決于交聯(lián)度。3、主要用途小孔徑凝膠用于脫鹽與小分子分離，大孔徑凝膠用于蛋白質(zhì)、核酸等大分子分離。4、衍生物葡聚糖結(jié)構(gòu)中引入-CH2-OH（羥丙基）即成為L(zhǎng)H系列凝膠。引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex）及二乙胺基乙基（DEAE-SephadexA）等。用途更廣，可用于脂類，激素和維生素等小分子分離，也適用于有機(jī)溶劑和極性有機(jī)溶劑緩沖液。LH系列的用途：①用于有有機(jī)溶劑的凝膠過(guò)濾②結(jié)合了凝膠過(guò)濾、分配色譜和吸附層析的特點(diǎn)，適用于其他凝膠難處里的樣品，能分離結(jié)構(gòu)非常相似的分子。③排阻極性與母體凝膠相同。④高負(fù)載長(zhǎng)壽命，高分辨率，可載樣300mg/ggel。（書(shū)本P167列出了它們的性能參數(shù)）二、瓊脂糖系列瓊脂糖凝膠（agarosegel）由經(jīng)過(guò)純化瓊脂糖制備的?？梢苑蛛x葡聚糖凝膠和生物膠所不能分離的大分子，使凝膠層析的分離區(qū)間擴(kuò)大到大分子和病毒顆粒，其最大范圍可達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量108，但是由于瓊脂有強(qiáng)烈的吸附作用，給使用造成了困難，后來(lái)，從瓊脂中分離出兩個(gè)組分，一個(gè)組分為帶負(fù)電荷的瓊脂果膠，含有磺酸基和羧基；另一組分叫瓊脂糖，它不含有帶電基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)為：β-D-吡喃半乳糖和3，6脫水-L-吡喃半乳糖相結(jié)合的鏈狀多糖。這種瓊脂糖被用來(lái)進(jìn)行凝膠層析，它既具有瓊脂凝膠相同的分離區(qū)間，又沒(méi)有吸附作用。但其穩(wěn)定性遠(yuǎn)不如葡聚糖凝膠和生物膠P，強(qiáng)酸強(qiáng)堿能引起結(jié)構(gòu)破壞。最好使用條件控制在pH4～9之間，溫度0～40℃，超出此范圍,可能被破壞。

瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來(lái)的天然凝膠。它的商品名因生產(chǎn)廠家不同而異。

瑞典的商品名稱為Sepharose，有3種型號(hào)，即Sepharose2B，4B和6B（同中國(guó)相同）。阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分含量。

美國(guó)的為Bio－GA，有6個(gè)型號(hào)，即Bio-G0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯?dāng)?shù)字乘以106表示排阻限度。英國(guó)的稱為Sagavac，又分為Sagavac2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分?jǐn)?shù)，F(xiàn)代表粉末狀，C代表顆粒狀。丹麥的稱為Gelarose，有5種類型，即2％，4％，6%，8％和10％；百分?jǐn)?shù)表示干膠量。瓊脂糖凝膠做成珠狀后不再脫水干燥，否則不能再溶脹恢復(fù)原有形狀，因此商品大都以含水狀態(tài)供應(yīng)，并應(yīng)在濕態(tài)保存。一般懸浮在l0-3mol/LEDTA和0.02%疊氮化鈉溶液中。1、Bio-gelA系列Bio-rad公司產(chǎn)，pH適應(yīng)范圍廣，4-13均有效。具體參數(shù)見(jiàn)表9-4（P168）2、Sepharose是應(yīng)用最廣，型號(hào)最多系列。性能見(jiàn)書(shū)P169表9-5。1）、Sepharose

最早的產(chǎn)品，為非交聯(lián)結(jié)構(gòu)。需在2-40℃使用，漸被淘汰。2）、SepharoseCL是瓊脂糖珠體與2，3-二溴丙醇交聯(lián)而成，經(jīng)堿水解除去硫酸根，減少了非特異性吸附?？?20℃高壓，也能用作離子交換劑和吸附劑。3）、Superose

珠狀瓊脂糖2次交聯(lián)制備的。提高了產(chǎn)品的剛性，增強(qiáng)了理化穩(wěn)定性。分離范圍更廣，分辨率更高。顆粒細(xì)小，剛性強(qiáng)粒度均勻，柱效高，可容許高流速，適用于中、高速層析系統(tǒng)。用于糖、核酸、病毒、變性劑中的蛋白質(zhì)純化。4）、SepharoseFastFlow高度交聯(lián)的瓊脂糖凝膠，高機(jī)械強(qiáng)度，高流速。性質(zhì)穩(wěn)定，非特異性吸附低，產(chǎn)物回收率高。三、聚丙烯酰胺系列聚丙烯酰胺凝膠也是一種人工合成凝膠，其商品名為生物凝膠P（Bio-gel-P），和交聯(lián)葡聚糖一樣，為顆粒狀干粉，在溶劑中能自動(dòng)吸水溶脹成凝膠。其由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺通過(guò)自由基引發(fā)聚會(huì)形成聚丙烯酰胺凝膠?？刂茊误w用量和交聯(lián)劑的比例，就能得到不同型號(hào)（孔徑）的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的結(jié)構(gòu)

在聚丙烯酰胺凝膠的合成過(guò)程中，單體和交聯(lián)劑的配比可以任意改變。以（T）代表100mL凝膠溶液中含有的單體和交聯(lián)劑總克數(shù)，稱為凝膠濃度。而其中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的百分比稱為交聯(lián)度，以（C）表示，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，交聯(lián)度越小，則網(wǎng)孔越大。聚丙烯酰胺凝膠全是由碳一碳骨架構(gòu)成，穩(wěn)定性較好，適合于做凝膠層析的載體。只有在極端pH條件下酰胺鍵才被水解為羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團(tuán)，故一般只在pH2～11的范圍內(nèi)使用。商品聚丙烯酰胺為顆粒狀的干粉，它有十分明顯形成塊狀并粘附在一起的傾向，在溶劑中能自動(dòng)溶脹成膠。聚丙烯酰胺凝膠的溶脹性質(zhì)和分離范圍的不同，可分成10種類型。各種類型均以英文字母P和阿拉伯?dāng)?shù)字表示，從Bio-GelP-2至Bio-GelP-300。P后面的阿拉伯?dāng)?shù)字乘以1000即相當(dāng)于排阻限度（按球蛋白或肽計(jì)算）。目前，美國(guó)Bio-RadLaboratories生產(chǎn)并出售多種規(guī)格的Bio-GelP。四、Sephacryl

系列由烯丙基葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺聚合交聯(lián)而成。易裝柱，流速高，分辨率高，穩(wěn)定。樣品體積適應(yīng)廣，從幾u(yù)m到幾千L均能用。五、Superdex

系列最新的凝膠介質(zhì)，由葡聚糖以共價(jià)方式與高交聯(lián)的瓊脂糖珠結(jié)合形成的符合凝膠。剛性強(qiáng)分辨率高，pH適應(yīng)性廣，產(chǎn)物回收率高，性質(zhì)穩(wěn)定。六、聚乙烯醇系列聚乙烯醇系列Toyopearl以交聯(lián)聚乙烯醇為骨架構(gòu)成的凝膠介質(zhì)，產(chǎn)生于1980 s年代。多孔的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大分子鏈上含許多-OH基團(tuán)，親水性強(qiáng)，與生物分子相容性好，常作為固定化酶的載體。七、Bio-BeadsS-X系列以多孔苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)形成的共聚物，適用于疏水性物質(zhì)和非水體系，以此為母基構(gòu)成相應(yīng)的離子交換劑。具體性能見(jiàn)書(shū)P172，表9-10。第四節(jié)離子交換法及離子交換劑的選擇一、離子交換法離子交換法是通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑可交換的離子進(jìn)行交換，達(dá)到分離純化的技術(shù)方法。主要依賴電荷間的相互作用，利用帶電分子中電荷的微小差異而進(jìn)行分離。該方法具有分辨率高、工作容量大、易于操作的特點(diǎn)。在生化分離中75%的工藝采用了離子交換法。選擇適當(dāng)條件可使一些溶質(zhì)分子變成離子態(tài)，通過(guò)靜電作用結(jié)合到離子交換劑上，而另一些物質(zhì)不能被交換，這兩種物質(zhì)就可被分離。帶同種電荷的不同離子雖都可以結(jié)合到同一介質(zhì)上，但由于帶電量不同，與介質(zhì)的結(jié)合牢度不同，改變洗脫條件可依次被洗脫而達(dá)到分離的目的。離子交換劑是一類能顯示離子交換的功能高分子材料。分為無(wú)機(jī)離子交換劑和有機(jī)離子交換劑。無(wú)機(jī)離子交換劑有機(jī)離子交換劑沸石、磺化煤離子交換樹(shù)脂離子交換長(zhǎng)期以來(lái)應(yīng)用于水處理和金屬的回收。在生物工業(yè)中，由于離子交換法分辨率高、工作容量大且易于操作，幾乎所有的生物分子都是極性的，都可使其帶電，所以離子交換法已廣泛用于生物分子的分離純化技術(shù)。主要應(yīng)用在抗生素、氨基酸、有機(jī)酸等小分子的提取分離。近年來(lái)在蛋白質(zhì)等生物大分子的分離提取也有應(yīng)用。離子交換樹(shù)脂的出現(xiàn)已有近80年的歷史.離子交換樹(shù)脂發(fā)展史上的3個(gè)重要階段1933年Adams和Hofms發(fā)明了縮聚類酚醛型陽(yáng)、陰離子交換樹(shù)脂,二戰(zhàn)及二戰(zhàn)后期離子交換樹(shù)脂大發(fā)展

1939年德國(guó)法本公司和1941年美國(guó)的樹(shù)脂產(chǎn)品和化學(xué)品公司先后開(kāi)始工業(yè)生產(chǎn)，在第二次世界大戰(zhàn)中，美國(guó)獲得了苯乙烯系和丙烯酸系加聚型離子交換樹(shù)脂合成的專利。它開(kāi)創(chuàng)了當(dāng)今離子交換樹(shù)脂制造方法的基礎(chǔ)。離子交換樹(shù)脂的發(fā)展50年代以后，開(kāi)展了膜狀離子交換樹(shù)脂的研究,開(kāi)辟了電化學(xué)的新領(lǐng)域。50年代末，60年代初期,又研制出耐壓、耐磨、高交換速度、能交換或吸著高分子量化合物的大孔離子交換樹(shù)脂。70年代以后，出現(xiàn)了各種大孔吸附樹(shù)脂及特種樹(shù)脂。

我國(guó)在1950年以后開(kāi)始離子交換樹(shù)脂的研究，

1956年何炳林提出并合成了大孔型離子交換樹(shù)脂

1958年，離子交換樹(shù)脂在國(guó)內(nèi)正式投入工業(yè)化生

其結(jié)構(gòu)由三部分組成：1.不溶性的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成的樹(shù)脂骨架，使樹(shù)脂具有化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度；2.是與骨架相聯(lián)的功能基團(tuán)；3.是與功能基團(tuán)帶相反電荷的可移動(dòng)的離子，稱為活性離子，它在樹(shù)脂骨架中的進(jìn)進(jìn)出出，就發(fā)生離子交換現(xiàn)象。功能基團(tuán)與可交換離子所帶電荷相反，以靜電作用，可進(jìn)行交換的離子稱為反離子或抗衡離子。反離子可與溶液中同種電荷離子進(jìn)行交換，交換反應(yīng)可逆，故離子交換劑和反復(fù)使用。操作方式有2種，1為正吸附，即將目的產(chǎn)物離子化吸附到介質(zhì)上，雜質(zhì)不被吸附而從柱中流出；產(chǎn)物純度高切被濃縮，適用于產(chǎn)物濃度低的且液體量大的溶液。2為反吸附，就是將雜質(zhì)吸附到介質(zhì)上，產(chǎn)物不被吸附而從柱中流出；所得產(chǎn)物純度不高，適用于產(chǎn)物濃度高的溶液。操作方法有間歇式分批操作和柱式操作2種。間歇式分批操作又稱靜態(tài)處理，是將離子交換劑浸泡在工作液內(nèi)，達(dá)到平衡后濾出介質(zhì)進(jìn)行洗脫。柱式操作也稱動(dòng)態(tài)法，交換、洗滌、再生均在離子交換柱內(nèi)進(jìn)行，也叫離子交換色譜法。二、生化用離子交換劑的特點(diǎn)1、親水性和生物相容性離子交換劑均具有較好的親水性和生物相容性，骨架則有的親水有的疏水，親水的在水中可溶脹成水溶膠，不與生物分子反應(yīng)。2、孔結(jié)構(gòu)介質(zhì)孔穴有3種，①凝膠孔，經(jīng)交聯(lián)大分子鏈間成孔，干態(tài)時(shí)柱體內(nèi)無(wú)孔隙，②大孔樹(shù)脂介質(zhì)孔，在有機(jī)溶劑存在時(shí)進(jìn)行聚合，干濕狀態(tài)下均存在，最大直徑達(dá)2.5×104-5×104nm。③瓊脂糖介質(zhì)孔，大小隨瓊脂糖濃度而定。這種介質(zhì)兼顧分子篩和離子交換作用。3、電荷密度生物大分子常有多個(gè)帶電點(diǎn)，能與多個(gè)功能基結(jié)合。這種多點(diǎn)結(jié)合與無(wú)機(jī)物（1︰1）結(jié)合不同，結(jié)合更牢，不易洗脫，造成不可逆吸附，故電荷密度適度才有利生物大分子分離，而不是密度越大越好。4、粒度粒度越小，分布越均勻，分離效果越好。粒徑越小，交換速度越快，因生物分子在珠內(nèi)路徑越短。5、純度①工業(yè)級(jí)用于純度不高用量很大的工藝過(guò)程。②分析級(jí)經(jīng)有機(jī)溶劑、螯合劑和高純度酸堿處理后的介質(zhì)。用于分析實(shí)驗(yàn)。③生物技術(shù)級(jí)粒徑小，分布均，適用一般生化分離和去離子操作。④分子生物級(jí)也叫無(wú)DNA級(jí)不存在核酸內(nèi)切酶、外切酶及連接酶抑制劑。三、生物大分子離子交換的機(jī)理與交換劑的選擇1、蛋白質(zhì)帶電性決定對(duì)交換劑的選擇（陽(yáng)/陰離子交換劑），蛋白質(zhì)帶電性決定于溶液pH值。2、離子交換劑強(qiáng)弱對(duì)酸性/陽(yáng)離子交換劑，pK越小酸性越強(qiáng)；堿性/陰離子交換劑，pK越大堿性越強(qiáng)。低pH（<3）時(shí)應(yīng)選擇強(qiáng)酸性介質(zhì)，高pH（>10）時(shí)應(yīng)選擇強(qiáng)堿性介質(zhì)；電荷密度特別高的分子應(yīng)采用弱離子交換劑，以避免不可逆吸附。3、螯合分離介質(zhì)選擇含螯合基團(tuán)，能與金屬離子螯合的分離介質(zhì)即螯合分離介質(zhì)。使用于含金屬離子的蛋白質(zhì)或除去產(chǎn)品中的金屬雜質(zhì)。4、選擇適宜工作條件，提高工作容量全交換容量每克干介質(zhì)/每毫升濕介質(zhì)所具有的功能基的含量。工作容量每克干介質(zhì)/每毫升濕介質(zhì)在一定操作條件下交換吸附蛋白的實(shí)際容量，也叫有效容量或動(dòng)力學(xué)容量。受溶液種類、pH、流速及雜質(zhì)等影響的可變參數(shù)?？梢?jiàn)，功能基的多少?zèng)Q定交換能力的大小，功能基種類決定其電性能。四、離子交換分離介質(zhì)使用應(yīng)注意的問(wèn)題1、預(yù)處理酸、堿或有機(jī)溶劑，使之轉(zhuǎn)變成所需的離子型2、裝柱均勻無(wú)氣泡和分層。3、流速影響吸附、洗脫效果，洗脫以慢速較好。4、適當(dāng)?shù)南疵撆c再生方式將顆粒內(nèi)、外表面吸附的分子解吸下來(lái)。由于溶液中不止一種蛋白，故常改變洗脫條件洗脫。5、消毒與樹(shù)脂復(fù)蘇高品質(zhì)生物制品要求對(duì)分離介質(zhì)消毒，除去微生物等混入其中。對(duì)交換容量下降的介質(zhì)則進(jìn)行復(fù)蘇，恢復(fù)交換能力。清除介質(zhì)中的“毒素”，使其恢復(fù)工作能力的過(guò)程就是復(fù)蘇。第五節(jié)離子交換劑的種類生化分離型介質(zhì)按介質(zhì)骨架分有天然多糖骨架和人工合成/半合成的介質(zhì)。目前國(guó)際上有100多個(gè)有關(guān)介質(zhì)品牌和品種。80%用于水處理。一、通用型離子交換樹(shù)脂功能基種類能用于水處理、濕法冶金、化學(xué)合成和醫(yī)藥工業(yè)等用途廣泛的離子交換樹(shù)脂叫通用型樹(shù)脂。強(qiáng)/弱酸性、強(qiáng)/弱堿性、螯合型；凝膠型、大孔型；按合成的單體分有苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系等。參考書(shū)P178表9-12二、通用型樹(shù)脂常用牌號(hào)用于從發(fā)酵液中分離有機(jī)酸、抗生素、氨基酸和天然產(chǎn)物提取等。見(jiàn)書(shū)P179表9-13和9-14。三、生化專用離子交換劑主要用于生化領(lǐng)域，其他領(lǐng)域使用很少，粒度較小的分離介質(zhì)。目前還是以多糖類骨架為主，一般