轉(zhuǎn)錄組和蛋白組

利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)研究乳酸菌脅迫條件下自身應(yīng)答機(jī)制郝彥玲副教授

食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院

2013年9月30日

食品微生物專題

轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）：廣義上指某一生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括信使RNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA及非編碼RNA；狹義上指所有mRNA的集合。1、轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)介紹基因組（genome）：指的是細(xì)胞或生物體中所有的DNA，包括所有的基因和基因間隔區(qū)。

轉(zhuǎn)錄組具有時空特異性FromSangertoNextGenerationSequencing2、蛋白組學(xué)技術(shù)的介紹

蛋白質(zhì)組(Proteome)：指由一個基因組或一個細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)(2D-Gel)

熒光差異凝膠電泳技術(shù)（2D-DIGE）

iTRAQ技術(shù)蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)：是等電聚焦電泳和SDS的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后在垂直的方向再進(jìn)行SDS（按照分子大?。?，經(jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質(zhì)圖。優(yōu)點(diǎn)：雙向電泳技術(shù)具有很好的分辨率和靈敏度，可以同時顯示組織或細(xì)胞內(nèi)各種蛋白，高分辨率確保蛋白質(zhì)最大程度的分離。缺點(diǎn)：重復(fù)性是很不理想。高重復(fù)性有利于凝膠間的對比。

熒光差異凝膠電泳技術(shù)（2D-DIGE）采用專有的熒光染料與多重樣本和圖象分析的方法，在同一塊膠上可同時分離多個由不同熒光標(biāo)記的樣品。

iTRAQ技術(shù)Whenchallengedwithbile,bacteriaareknowntomodifytheircellenvelopepropertiessuchascellmembranefattyacidcomposition,peptidoglycancompositionandmembranecharge.Exposuretobileisaseriouschallengetotheviabilityofprobioticsbecausetheconcentrationofbileacidsinthehumansmallintestinetypicallyvariesbetween0.2and2%Bilestresscanalsocausedeleteriouseffects,includingproteinmisfoldinganddenaturation,DNAdamage,secondarystructureformationinRNA,andintracellularacidification.14and22spotsweresignificantlyoverexpressedatthe0.6g/Land1.2g/Lbilesalts.Only4spotsweresignificantlydown-regulatedatthebothconcentrations.3spotswereonlydetectedonlywhenbilesaltswereaddedtothemedium.Oxbileextractpromotesinductionofgeneralstressresponseproteinsthematurationofnewlysynthesizedproteins,refoldinganddegradationofdenaturedproteinsandDNArepairs,suchasGroELandDnaK（2）Severalenzymesinvolvedincarbohydratecatabolism,includingthekeyenzymeoftheso-calledbifidobacterialshunt,areoverexpressedincellsgrowninthepresenceofbilesalts（4）Regulationbybilesaltsofproteinsinvolvedintranscription,translation,andmetabolismofaminoacidsandnucleotides.（3）生理指標(biāo)的檢測：Endmetabolicproducts（lactate,acetateandformate）andF6PPKweredetected.利用2-Dgel結(jié)合實(shí)時定量進(jìn)行研究，創(chuàng)新點(diǎn)是推測出丙酮酸的代謝流向飽和脂肪酸，從而增強(qiáng)了膜的rigidityandimpermeability.轉(zhuǎn)錄組：基因芯片技術(shù)蛋白質(zhì)組：2D-DIGE技術(shù)在0.2%的oxgal中培養(yǎng)，316基因，42個蛋白質(zhì)發(fā)生顯著變化。2011：

ResultsandDiscussion（1）GGAltercellsurfacepropertiesandexpressionmultipleABC-typemultidrugtransporterinresponsetobile.（2）Two-componentregulatorysystemsandbilesalthydrolasemodulatecellularresponsetobile（3）BileinducescommonstressresponseinGG.

（4）Bileaffectscentralmetabolicprocesses典型文章實(shí)驗(yàn)手段：DNA芯片和實(shí)時定量PCR。推測結(jié)果：通過轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)Genesencodingthreetransportsystemsbelongingtothemajorfacilitatorsuperfamily(MFS),Bbr_0838,Bbr_0832,andBbr_1756,andthreeABC-typetransporters,Bbr_0406-0407,Bbr_1804-1805,andBbr_1826-1827在膽鹽脅迫下表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，推測可能參與膽鹽脅迫。創(chuàng)新點(diǎn)：利用膽鹽缺陷型的L.lactisNZ9000lmrCD作為宿主，通過異源表達(dá)證明其參與膽鹽抗性。問題：酸奶對人體具有重要的益生保健功能，但是后酸化是制約酸奶行業(yè)發(fā)展的主要問題。原因：當(dāng)pH值從6.5下降到5.5時，嗜熱鏈球菌的生長逐漸減慢，pH值下降到5.0后，保加利亞乳桿菌控制了酸奶的發(fā)酵（郭清泉等，2001）。

立題的背景

后酸化：酸奶在正常發(fā)酵結(jié)束后的貯存、運(yùn)輸和銷售過程中，發(fā)酵微生物的繼續(xù)生長會導(dǎo)致產(chǎn)品pH值持續(xù)降低，進(jìn)而發(fā)生后酸化現(xiàn)象（徐成勇等，2006）

乳酸菌酸耐受機(jī)制的研究進(jìn)展質(zhì)子泵F0F1-ATPase

（Arikadoetal.,1999）谷氨酸脫羧酶途徑GAD

（Sandersetal.,1998）精氨酸脫氨酶途徑ADI

（Curranetal.,1995;DeAngelisetal.,2002）應(yīng)激蛋白和分子伴侶蛋白（Hartkeetal.,1996；

Coxetal.,2000）改變細(xì)胞膜的脂肪酸構(gòu)成（CotterandHill,2003）（CotterandHill,2003）保加利亞乳桿菌的酸耐受機(jī)制的特殊性對保加利亞乳桿菌全基因組序列的分析表明,僅具有F0F1-ATPase基因簇缺失一些存在于其他乳酸菌中的pH調(diào)節(jié)相關(guān)的基因，如ADI途徑中的arcA,B,C,T,D,R基因和GAD途徑中的gadC,B基因（vandeGuchteetal.,2006）保加利亞乳桿菌的酸適應(yīng)機(jī)制研究情況利用蛋白組學(xué)技術(shù)研究保加利亞乳桿菌經(jīng)低pH誘導(dǎo)后的全蛋白表達(dá)情況如，

Limetal.,2000；

Fernandezetal.,2008；Streitetal.,2008利用反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時定量PCR的方法，考察保加利亞乳桿菌中酸耐受相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化如，

Penaudetal.,2006中發(fā)現(xiàn)酸處理后銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CPX-TypeATPase的Ldb0660和Ldb1239基因大幅上調(diào)對于保加利亞乳桿菌感受環(huán)境壓力并作出適應(yīng)性調(diào)節(jié)這一過程的分子調(diào)控機(jī)制缺少系統(tǒng)性的研究2.研究目的及意義本課題擬采用蛋白組學(xué)、RT-qPCR、乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌單雜交和EMSA等分子生物學(xué)技術(shù)，對酸脅迫反應(yīng)中的關(guān)鍵基因進(jìn)行分離鑒定及功能研究。進(jìn)一步揭示保加利亞乳桿菌酸耐受機(jī)制；為制備弱后酸化的保加利亞乳桿菌奠定基礎(chǔ)；為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的酸奶發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。3.研究內(nèi)容134蛋白組學(xué)方法分析保加利亞乳桿菌應(yīng)對酸脅迫過程中的差異表達(dá)蛋白細(xì)菌單雜交和EMSA實(shí)驗(yàn)分析抗酸脅迫中新轉(zhuǎn)錄因子Ldb0667的功能2RT-qPCR分析差異基因轉(zhuǎn)錄水平的變化提出保加利亞乳桿菌酸耐受模型4.研究結(jié)果SurvivalofL.bulgaricusCAUH1afteracidadaptation.Acidadapted(40minattheindicatedpH)andcontrol(pH6.5)samplesweresubjectedtoanacidchallenge(60minatpH3.7).OD600

nm=

～0.4pH4.8,40min--700倍確定酸脅迫處理?xiàng)l件：致死處理?xiàng)l件：pH3.7,60min蛋白質(zhì)雙向電泳處理組對照組47pI47pIMW10904020MW10904020平均每塊膠得到644個蛋白點(diǎn)，經(jīng)ImageMaster2DPlatinumsoftware

分析，選取變化幅度大于1.5倍的蛋白點(diǎn)41個進(jìn)行質(zhì)譜鑒定Results

通過MALDI-TOF/TOF二級質(zhì)譜鑒定了27個差異蛋白（17個上調(diào)，10個下調(diào)），利用NCBIBLAST、KEGG等數(shù)據(jù)庫，確定其功能和參與的代謝途徑糖類代謝:10proteins(GlcK,Eno,Pyk,GpmA,GpmB,Gap,Ack,Gpd,XfpandPgl)核苷酸代謝:3proteins(PyrG,CmkandPurR)翻譯過程:7proteins(Tuf,FusA,TypA,Der,RplM,RpsSandRpsA)氨基酸代謝:2proteins(PepO1andPepN)脅迫反應(yīng):1

proteins(ClpC)未知功能:proteins(RnjA,Ldb0677andPthA)蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果IDSpotno.ExpressionfactorA/NAGeneProteinAccessionno.2-DERT-qPCR糖酵解途徑K144561.823.14glcKGlucokinase（葡萄糖激酶）YP_618316.1K226643.7229.86Ldb1036Fructose-2,6-bisphosphatase（果糖-2,6-二磷酸酶）YP_619006.1M15596-1.85-14.42gapGlyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（3-磷酸甘油醛脫氫酶）YP_618713.1M236141.8313.45enoEnolase（烯醇化酶）YP_619161.1L111751.8610.78pykPyruvatekinase（丙酮酸激酶）YP_618880.1K45801.595.10gpmAPhosphoglyceratemutase（磷酸甘油酸變位酶）YP_618404.1L6304-1.61-22.32ackAcetatekinase（乙酸激酶）YP_618754.1戊糖磷酸途徑M12180-1.51-6.68gpdGAPDH（磷酸葡萄糖脫氫酶）YP_619397.1M2110-1.53-24.76Ldb0534phosphoketolase（磷酸酮醇酶）YP_618635.1K103821.704.92Ldb0588putative3-carboxymuconatecyclaseYP_618678蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果IDSpotno.ExpressionfactorA/NAGeneProteinAccessionno.2-DERT-qPCR伴侶蛋白L47-2.04-13.45clpCATP-bindingsubunitClpCgb|EGD26863.1|核苷酸代謝K375-1.48-20.25pyrGCtpsynthase（CTP合成酶）YP_004033330.1M175431.5123.43Ldb0774Cytidylatekinase（胞苷酸激酶）YP_812822.1L13554-1.62-21.86purRPuroperonrepressor（pur操縱子阻遏蛋白）YP_812402.1肽類降解M2641.6218.90pep01Endopeptidase（肽鏈內(nèi)切酶）YP_618394.1M203271.509.97pepNAminopeptidaseN（氨肽酶N）YP_619704.1轉(zhuǎn)錄-翻譯相關(guān)K247472.7323.75tufPutativeelongationfactorTuYP_618840.1M13561.885.66fusAElongationfactorGYP_618520.1N175131.47fusAElongationfactorGYP_618520.1K9142-1.74-13.55engAGTP-bindingproteinEngAYP_618891.1K113201.542.69typAGTP-bindingproteinTypAYP_618827.1

蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果IDSpotno.ExpressionfactorA/NAGeneProteinAccessionno.2-DERT-qPCR核糖體蛋白M137941.762.18rplM50SribosomalproteinL13YP_812477.1K19533-1.52-10.93rpsA30Sribosomalprotei