抗體的分離純化原理和測(cè)定

第八章抗體的分離純化及測(cè)定食品學(xué)院廖振林第一節(jié)抗體的分離純化

無論是將抗體用于研究還是用于檢測(cè)或臨床治療，均需對(duì)抗體進(jìn)行分離與純化。分離：將抗體從其存在的體液或培養(yǎng)液中分離出來并加以初步純化。純化：提高分離出來的抗體的純度，并將其中的雜質(zhì)控制在所需的低水平。對(duì)治療性抗體尤為重要。分離純化的方法可依據(jù)抗體的特性進(jìn)行分離純化：據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異，以鹽析的方法將抗體與其他蛋白分開；據(jù)抗體帶有電荷的不同，用離子交換，電泳等技術(shù)分離…..按分離方法：沉淀、鹽析、膜技術(shù)、電泳、色譜等。其中只有電泳和色譜法可以將抗體精細(xì)分離即純化。一、鹽析法（一）原理蛋白質(zhì)的溶解度在一定范圍內(nèi)隨鹽的濃度變化而變化。在低鹽濃度下溶解度隨著鹽濃度升高而增加，當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定水平時(shí)，其溶解度又以不同程度下降并先后析出。其原理是由于蛋白質(zhì)分子的極性基團(tuán)有著靜電引力，當(dāng)水中加入少量鹽類時(shí)，鹽類離子與水分子對(duì)蛋白質(zhì)分子上的極性基團(tuán)的影響，使蛋白質(zhì)在水個(gè)溶解度增大。但鹽濃度增加到一定程度時(shí)，水的活度降低，蛋白質(zhì)表面的電荷被中和，水化膜破壞，致使蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀。鹽析法就是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度不同面達(dá)到彼此分離的方法。（二）鹽的選擇

蛋白質(zhì)鹽折常用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨，其優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小，溶解度大(25℃時(shí)飽和溶解度為4.1mol/L，即767g/L)。在不同飽和度的硫酸銨溶液內(nèi)，不同蛋白質(zhì)依次析出，而且硫酸銨價(jià)廉易得，分段效果好，不容易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨濃溶液的pH常在4.5—5.5之間，市售的硫酸銨還常含有少量游離硫酸，pH往往在4.5以下，需用氨水調(diào)節(jié)其pH至7.0左右。(三)鹽析時(shí)需注意的問題1.鹽的飽和度鹽的飽和度是影響蛋白質(zhì)鹽析的主要因素，不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同。分離幾個(gè)混合組分的蛋白質(zhì)時(shí)，鹽的飽和度常由低到高逐漸增加，每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀進(jìn)行離心分離后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種蛋白質(zhì)沉淀。如用硫酸銨鹽析分離血漿蛋白，當(dāng)飽和度達(dá)20％時(shí)，纖維蛋白原首先析出；飽和度增至28％—33％時(shí)，優(yōu)球蛋白析出；飽和度達(dá)33％—50％時(shí)，球蛋白析出；飽和度大于50％以上時(shí)，清蛋白析出。免疫球蛋白常在飽和皮為33％開始析出。2.pH在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度最?。菀壮恋砦龀觥Ｒ虼?，鹽析時(shí)除個(gè)別特殊情況外，pH常選擇在被分離的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。

3.蛋白質(zhì)濃度在相同鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越高越易沉淀，高濃度雖對(duì)沉淀有利，但濃度過高，也容易引起其它蛋白質(zhì)的共沉淀，因此，必須選擇適當(dāng)濃度，盡可能避免共沉淀作用的干擾。4．溫度出于高濃度的鹽溶液對(duì)蛋白質(zhì)有一定保護(hù)作用，鹽析操作一般可在室溫下進(jìn)行，但在使用某些中性鹽進(jìn)行鹽析時(shí)，溫度對(duì)鹽溶解度的影響比較明顯。

5.脫鹽蛋白質(zhì)用鹽析沉淀分離后，常需脫鹽才能獲得純品。最常用的脫鹽方法是透析。通過透析袋內(nèi)外的離子交換，最后使透析袋內(nèi)溶液的鹽濃度與外界相一致。當(dāng)然，也可以使用凝膠過濾或超濾的方法除鹽。二、膜分離技術(shù)

可以形象地將膜分離技術(shù)比喻成以多孔膜進(jìn)行過濾或過篩子的過程。在實(shí)際操作時(shí)，由于膜上的孔很小，需使用一定的壓力，才能將含有待分離物質(zhì)的液體驅(qū)動(dòng)通過分離膜，使具有不同分子量的物質(zhì)或通過膜、或截留于膜上而得到分離。有多種膜技術(shù)可用于抗體的分離與純化。但最基本的是使用超濾膜。超濾膜的孔徑在1—100nm之間，其截止到分子量的范圍為幾百至一百萬，所需的驅(qū)動(dòng)壓力在0.1—1.0MPa左右。(一)超濾膜的基本性能

作為膜分離材料，超濾膜的基本性能可以用透水率和截留分子量加以表征。

1．透水速率在一定的驅(qū)動(dòng)壓力下，單位面積的膜在單位時(shí)間里所能透過的水的量稱為該膜的進(jìn)水率(Jf)。式中Jf為進(jìn)水率，ρ為滲透系數(shù)，ΔP為壓力差，Δπ是料液的滲透壓差，ι是透過水流通道的長(zhǎng)度，它正比于膜的厚度。通常情況下，由于Δπ很小，所以可以忽略不計(jì)、此時(shí)，透水率可簡(jiǎn)化表達(dá)為即透水率與操作壓力成正比，與膜厚呈反比。由于膜在使用過程中會(huì)發(fā)生污染和孔結(jié)構(gòu)的改變，因而在使用過程中，其透水率會(huì)逐漸發(fā)生變化。所以定義其初始運(yùn)水量Qz和穩(wěn)定透水量Qs之比為穩(wěn)定系數(shù)Sm，即一般情況下，Sm=0.6-0.8,不同規(guī)格和品種的膜的透水率相差很大。同時(shí)，不同的操作條件與參數(shù)，也會(huì)對(duì)實(shí)際透水量產(chǎn)生影響，這些參數(shù)包括操作壓力、料液流速、溫度以及料液的性質(zhì)等。一般情況下，在膜使用的開始和結(jié)束時(shí)，可以實(shí)際測(cè)定一下透水率。當(dāng)透水率已經(jīng)降低時(shí)，應(yīng)考慮將其清洗并再生，以恢復(fù)其透水率。2．截留分子量超濾膜的另一基本性能是標(biāo)稱截留分子量。它的定義是指溶液中被截留的溶質(zhì)中最小的分子量。對(duì)于“截留分子量”這個(gè)指標(biāo)，不應(yīng)做機(jī)械式的理解。例如，使用截留分子量5萬的膜時(shí)，分子量68萬的牛血清白蛋白也可通透過去。這是因?yàn)?，一方面，膜上的孔的大小是不均勻的，一般情況下，有一個(gè)孔徑分布。另一方面，由于分子的形狀不同且分子鏈具有柔性，分子量相同的線型分子和球型分子的透過率是不同的，線型分子更容易透過。通常，廠家給出的截留分于量指的是截留率90％時(shí)，相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)(或其它水溶性高聚物)的分子量。在實(shí)際使用時(shí)應(yīng)注意以下幾個(gè)問題：①一般超濾膜的截留分子量曲線多呈S形(如圖8-1)。S形透過率曲線的線性部分越陡，則截留性能亦越佳。②蛋白質(zhì)分子呈球形者其截留特性優(yōu)于呈線性者。因此，應(yīng)注意廠家給出的截留分子量是何種物質(zhì)為樣品所測(cè)定。一般情況下，裁留率順序?yàn)椋呵虻鞍?gt;支鏈高聚物>直鏈(線型)高聚物。③廠家給出的截留分子量是以單一蛋白質(zhì)(或水溶性大分子)為樣品所測(cè)定的。但是，實(shí)際樣品往往極為復(fù)雜，如體系中有多種蛋白質(zhì)存在時(shí)，膜的特性會(huì)因?yàn)闈獠顦O化現(xiàn)象、‘‘凝膠層的形成”以及樣品間形成復(fù)合物等現(xiàn)象而有所改變。圖8-1

截留分子量曲線(二)常用的超濾膜

用于生化分離的超濾膜，因使用目的的不同，有很多不同的種類和規(guī)格。若按其制造材料分，有醋酸纖維素(CA)、三醋酸纖維素(CTA)、聚砜(PS)、聚酰胺(PA)、聚酰亞胺(PI)、聚丙烯腈輕(PAN)、聚醚醚酮(PEEK)以及聚偏氟乙烯(PVDF)等。其中，以醋酸纖維素和聚砜制備的膜最為常用。膜的使用形式有平板膜、平板膜堆、管式膜、卷式膜以及中空纖維膜。其截留分子量自500-30萬不等，可按需要加以選擇。例如，當(dāng)分離IgG時(shí)，若使用截留分子量5萬以下的膜，均可達(dá)到98％的高截留率；使用截留分子量10萬的膜，截留率下降至95％。超濾膜的生產(chǎn)廠家很多，但適合于生化分離的產(chǎn)品也很有限。表8-1列出了代表件的廠家及其產(chǎn)品。三色譜法

（一）概述色譜(chromatography)，早期的文獻(xiàn)上曾翻譯為“層析”，具意義是很準(zhǔn)確的。前國(guó)內(nèi)使用較多的則是“色譜”一詞。色譜是一種現(xiàn)代分離、分析方法，也是研究物理、化學(xué)和生物過程的很好的工具。色譜分離過程的本質(zhì)是溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間分配的差異。任何兩種不同的物質(zhì)，只要它們存在有不同的物理、化學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)上的差異，而且還表現(xiàn)于在不同物相上分配系數(shù)的差異的話，它們便都可以在色譜過程中得到分離、分析或測(cè)定。這里，所謂不同的物相可以包括氣相、液相、固相和超臨界相。不同物相的配合，可以得到不同的色譜類型，如氣相色譜系以氣相為流動(dòng)相，以固相或載有液相的固體為固定相進(jìn)行物質(zhì)的分離；液相色譜則以液體為流動(dòng)相，以廣義的固相為固定相而進(jìn)行分離。通常，均將固定相裝填于柱子中，即以色譜柱的形式進(jìn)行工作。因此，色譜柱是進(jìn)行色譜分離的主要場(chǎng)所。發(fā)生在色譜柱中的分離過程受熱力學(xué)因素和動(dòng)力學(xué)因素的控制。為得到滿意的分離，首先必須考慮固定相的性質(zhì)從其與溶質(zhì)相互作用的強(qiáng)弱，這主要體現(xiàn)在色譜柱填料(在生物學(xué)文獻(xiàn)上常稱為“介質(zhì)”)的設(shè)計(jì)、合成及選擇。為使不同的物質(zhì)盡可能地得到分離，亦即色譜峰盡可能地高而窄(色譜學(xué)的術(shù)語稱之為“譜帶展寬盡可能地小”)，就需要對(duì)柱子進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)．并將填料填充成性能優(yōu)良的柱子。同時(shí)，由于流動(dòng)相的種類與使用條件既可影響動(dòng)力學(xué)因素，又影響熱力學(xué)因素，故必須正確地選擇并優(yōu)化色譜條件，才能得到滿意的分離。

假設(shè)有兩個(gè)溶質(zhì)A和B，將它們注射進(jìn)色譜柱后，便會(huì)在流動(dòng)相的攜帶下通過色譜柱并獲得分離。在柱子出口處設(shè)置一個(gè)檢測(cè)器，便能記錄下流經(jīng)出口的溶質(zhì)的濃度的變化。這種濃度—時(shí)間曲線便是該物質(zhì)的色譜圖(圖8-2)。色譜圖上，可以見到溶質(zhì)的色譜峰：如A峰、B峰。同時(shí)，也有不保留物質(zhì)或雜質(zhì)形成的峰。沒有峰時(shí)的信號(hào)軌跡形成基線。從色譜圖上，可以直接得到或通過計(jì)算得到一系列的色譜參數(shù)，如保留時(shí)間、峰高、峰寬等。表8-2匯總了主要的色譜參數(shù)及其定義。圖8-2色譜圖及其參數(shù)上面所舉出的各種色譜參數(shù)和名詞中，最重要的是保留時(shí)間TR、保留體積VR、容量因子K’、分離因子α以及分離度R。保留時(shí)間和保留體積指的是色譜峰出現(xiàn)的時(shí)間；容量因子，表示樣品在固定相上的被吸附的程度；分離因子表示樣品的選擇性的大小；分離度則用以表示兩個(gè)色譜峰分離的程度。按照分離原理的不同，可以將色譜方法分成不同的模式(表8-3)。

當(dāng)然，表中所例舉的各種色譜模式，還可以再細(xì)分為不同的類別。在抗體的分離、純化中，用得最多的是離子交換色譜、凝膠色譜與親和色譜。在以色譜技術(shù)進(jìn)行抗體的分離純化時(shí)，還應(yīng)注意柱色譜和高效液相色譜(HPLC)的區(qū)別，以便實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的最有效、最合理的分離。在通常的柱色譜中，多使用軟質(zhì)凝膠或強(qiáng)度較好的半硬膠為基質(zhì)，填料的粒徑約40-150um。

（二）凝膠過濾

凝膠過濾是體積排除色譜的一種。在排除色譜中，溶質(zhì)即待測(cè)樣品組分，與填料(或介質(zhì))以及流動(dòng)相之間沒有額外的相互作用，樣品只依據(jù)其分子體積(流動(dòng)力學(xué)體積)的大小而分離。

1953年，Porath和Flodin首先用交聯(lián)預(yù)聚糖凝膠在水溶液中分離水溶性高分子，其商品名稱即Sephadex，由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，立即得到了生物醫(yī)藥界的承認(rèn)和廣泛的應(yīng)用。這種分離技術(shù)被稱為凝膠過濾。

1964年出現(xiàn)的以苯乙烯—二乙烯苯共聚物為基質(zhì)的不同孔徑的有機(jī)高分子凝膠，解決了分子量幾千至幾百萬的合成高分子的體積排除色譜分離問題。其后，體積排除色譜得到了快速發(fā)展并日臻完善，成為高效液相色譜家族中重要的一員。凝膠過濾色譜的突出優(yōu)點(diǎn)：①出峰迅速，任何組分的保留體積均在Vi和V0之間，且不需要梯度淋洗；②溶質(zhì)與固定相(填料)和流動(dòng)相之間沒有相互作用；③分離時(shí)不會(huì)滯留雜質(zhì)或殘留物在柱上，故柱壽命長(zhǎng)；④可用以測(cè)定生物大分子的分子量；⑤生物相容性好，有很高的活性回收率；⑥柱負(fù)載較大，利于制備分離。缺點(diǎn)：分辨率及峰容量均相對(duì)較低。1．原理凝膠過濾色譜是在裝填有多孔性材料的色譜柱中進(jìn)行的。多孔材料的孔有大有小?？讖接衅洹翱讖椒植肌保?dāng)流動(dòng)相攜帶分子量不同的溶質(zhì)進(jìn)入色譜柱后，因濃度差而可能滲入或擴(kuò)散進(jìn)入填料的孔中：也就是說，溶質(zhì)在兩相中的運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力是濃度梯度。但是，分子體積的大小，造成了在孔中擴(kuò)散路徑的差異，這可以從圖8-3看出：?jiǎn)慰字械捏w積排除

形象地說，填料顆粒上的孔有大有小，但對(duì)于溶劑分子來說，它們是足夠大的，可以允許它們自由地?cái)U(kuò)散、進(jìn)出。但是，對(duì)于體積大的分子來說，它們只能進(jìn)入尺寸比它大的孔；對(duì)于比顆粒上的孔還要大的分子，則只能從孔旁流過。換句話說，分子量或分子體積較小時(shí)，能占有更多的孔體積。這樣，分子體積不同的混合物一齊進(jìn)入柱端時(shí)．經(jīng)過淋洗、擴(kuò)散，總是體積大的分子先流出柱子，小分子物質(zhì)(即體積小)因進(jìn)入凝膠顆粒，行程延長(zhǎng)而滯后流出．從而使兩者得以分離。2．常用的凝膠種類凝膠是膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，不論是天然凝膠還是人工合成凝膠，它們的內(nèi)部都具有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。用于凝放過濾的常用凝膠有以下幾種：(1)交聯(lián)葡聚糖凝膠(2)瓊脂和瓊脂糖凝膠

(3)聚丙烯酰胺凝膠

(4)其它凝膠過濾介質(zhì)(1）交聯(lián)葡聚糖凝膠

交聯(lián)葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex)，是最早出現(xiàn)的凝膠過濾介質(zhì)。其基本骨架是葡聚糖，由許多右旋葡萄糖單位通過l,6-糖苷鍵連接成鏈狀結(jié)構(gòu)，再由3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷作交聯(lián)劑，將鏈狀結(jié)構(gòu)連接起來形成具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。其網(wǎng)孔大小可通過調(diào)節(jié)交聯(lián)度和葡萄糖的比例以及反應(yīng)條件來控制，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越疏松。交聯(lián)葡聚糖凝膠化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可工作于pH2-11范圍內(nèi)。表8-4列出了其規(guī)格性質(zhì)。(2)瓊脂和瓊脂糖凝膠：

瓊脂來源于一種海藻，其結(jié)構(gòu)為D-乳糖和3,6-無水-L-乳糖兩種糖的殘基所組成的多聚糖。瓊脂糖有較大的孔隙，允許較大分子滲入，能分離較高分子量的物質(zhì)，其工作范圍遠(yuǎn)大于交聯(lián)葡聚糖和聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠的最大缺點(diǎn)是它帶有大量電荷(主要是璜酸基，也有一定量的羥基)，過濾時(shí)常需使用較高離子強(qiáng)度的洗脫液，使分離物質(zhì)中的鹽濃度過高，影響純度。因不同廠家而異，主要商品有Sepharose系列等，其種類和特性見表8-5。(3)聚丙烯酰胺凝膠：

它是一種人工合成的凝膠，如生物凝膠-P(Bio-gel-P)，產(chǎn)品為顆粒狀干粉，在溶劑中能自動(dòng)吸水膨脹成凝膠。聚丙烯酰胺系內(nèi)丙烯酰胺經(jīng)自由基聚合而成的線性高聚物，與甲叉雙丙烯酰胺共聚能生成交聯(lián)的聚丙烯酰胺，經(jīng)干燥粉碎或加壓成形處理即成生物凝膠-P。除了聚丙烯酚胺凝膠，完全是出碳—碳骨架構(gòu)成的．機(jī)械強(qiáng)度較好，適宜作為凝膠過濾的介質(zhì)。缺點(diǎn)是不耐酸，遇酸時(shí)酰胺鍵會(huì)水解成羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團(tuán)，影響其使用范圍。（如表8-6）3．凝膠的選擇

前述各種凝膠在微觀結(jié)構(gòu)上是很相似的，它們都是三維空間網(wǎng)狀交織的高分子聚合物。所能適用的分子量范圍，主要決定于凝膠顆粒內(nèi)部微孔孔徑的大小?；旌衔锏姆蛛x程度，則取決于凝膠的粒度和凝膠的結(jié)構(gòu)。凝膠的粒度一般分為三級(jí)：40—60篩孔屬粗粒，100—200篩孔屬細(xì)粒．250—400篩孔屬最細(xì)粒；也有的廠家將其按粒徑劃分，即粗(200—600)、中(100—300)、細(xì)(40—160)和超細(xì)(20—80)四級(jí)。其中，以細(xì)粒的應(yīng)用較多，因?yàn)樗苁瓜疵撉€的峰區(qū)變得對(duì)稱而狹窄；使用過細(xì)的凝膠時(shí)，因洗脫阻力增大，使洗脫時(shí)間延長(zhǎng)。

與凝膠孔徑大小有直接關(guān)聯(lián)的是凝膠中的瓊脂糖或葡聚糖的比例，以及凝膠的交聯(lián)度；凝膠交聯(lián)度越高，孔徑越小，反之孔徑就越大。應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)分子量的大小與形狀，選擇不同孔徑和文聯(lián)度的凝膠。此外，如果用于脫鹽，則宜選擇SephadexG25等排阻極限較小的凝膠。4．凝膠的填裝

商品凝膠是干燥的顆粒，使用前需充分膨脹。（煮沸可充分溶脹，消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌。排除氣泡）。裝柱前凝膠應(yīng)充分洗滌，除去細(xì)顆粒，并減壓抽氣排除氣泡。將處理好的凝膠以適宜的緩沖液懸浮起來，趁其尚未沉降時(shí)，均勻而連續(xù)地傾倒入垂直放置的空柱子中。柱子的底部，應(yīng)預(yù)先放有過濾網(wǎng)或篩板。開放柱子底部活塞或螺旋夾，令緩沖液流出，而凝膠則滯留在柱子中形成均勻而穩(wěn)定的柱床。在這一過程中，切忌流干或部分流干。填裝軟凝膠的柱子時(shí)，須注意不可使凝膠受到過高的壓力，不宜使用減壓或加壓的方法；而硬膠，即高交聯(lián)度的凝膠，則可使用水泵減壓或以蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)的方法加速柱床的形成。5．凝膠柱的檢查

樣品的分離效果主要取決于裝填起來的層析床是否均勻。為了確保分離效果，使用前應(yīng)檢查凝膠柱的質(zhì)量。即用肉眼觀察層析床是否均勻，有無“紋路’’或氣泡，或向?qū)游龃布尤氪蠓肿佑猩镔|(zhì)，觀察色帶移動(dòng)。色帶狹窄，均勻和平整即說明柱子性能良好。色帶出現(xiàn)歪曲，散亂，變寬時(shí)必須重新填裝柱子。（三）離子交換色譜1．原理在適宜的載體上，例如在纖維素，瓊脂糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠以及各種合成高聚物型凝膠上，通過酯化、醚化或氧化等化學(xué)反應(yīng)，引入具有堿性或酸性離子基團(tuán)，便可制備出各種類型的離子交換填料。按照表面基團(tuán)的不同，可以將離子交換填料分成陰、陽兩類，其中又有強(qiáng)、中、弱之分。常見四種類型是：強(qiáng)陰型(SAX)，如[N(CH3)3]+(QAE)

中陰型(MAX)，如一O一(CH2)2一N(C2H5)2(DEAE)

強(qiáng)陽型(SCX)，如一SO3-H+(SA)

弱陽型(WCX)，如一OCH2COOH(CM)

當(dāng)離子交換填料帶有陽離子基團(tuán)時(shí)，便可交換陰離子樣品，稱之為陰離子交換樹脂；當(dāng)交換劑帶有陰離子基團(tuán)時(shí)，便可交換陽離子樣品，稱之為陽離子交換樹脂。將所需的離子交換樹脂制備成柱后，便可將其用于蛋白質(zhì)、酶、激素以及病毒等的分離。

通過改變流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度，便能以可逆的吸附和釋放作用，在柱子上分離蛋白質(zhì)樣品，達(dá)到純化之目的。由于各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子大小、電荷及與離子交換劑結(jié)合的強(qiáng)度不同，故可利用不同的置換條件將它們分開。由于各種離子交換劑吸附和釋放的能力不同，可以被不同的緩沖液洗脫。有些蛋白質(zhì)層析時(shí)應(yīng)改變洗脫液PH值。以減少蛋白質(zhì)分子上的電荷數(shù)目；或適當(dāng)增加鹽類濃度，與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位置，以減低靜電鍵的結(jié)合可達(dá)到分離(表8-7)。2常用離子交換劑

從原則上講，任何親水凝膠均可以作為基質(zhì)，再經(jīng)過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾而制備出各種離子交換劑。因此，相應(yīng)的離子交換劑也有纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等系列。根據(jù)離子交換劑的性能，又可分為陽離子交換劑，陰離子交換劑兩大類。表8-8、8-9及8-10為常用的一些離子交換劑種類。3．羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)

羥基磷灰石是一種特殊的離子交換劑，其主成分為羥基磷酸鈣。天然的羥基磷灰石屬六方晶體，由于有很好的生物相容性，故可以用作生物醫(yī)學(xué)材料。1983年Bio-Rad公司生產(chǎn)并開始銷售由無定形羧基磷灰石填充的高效液相色譜柱。實(shí)際上，這種羥基磷灰石系由細(xì)小的片狀結(jié)晶所織成，因而柱效、柱子的通透性以及柱床的穩(wěn)定性均不是很好。由于粒徑的減小，使得色譜柱的阻力增高，只能用于高效液相色譜，而不能用于通常的柱色譜。

正是由于羥基磷灰石的化學(xué)組成和晶體結(jié)構(gòu)特性，使得它具有獨(dú)特的分離機(jī)理。羥基磷灰石晶體上有兩種不同的晶面，形成了兩種具有不同吸附特性的吸附位點(diǎn)，即位于Ca2+離子上的吸附陰離子的位點(diǎn)和位于[PO43-]離子上的吸附陽離子的位點(diǎn)。而OH-不參與吸附過程。這種吸附作用的機(jī)理，使得它具有很高的吸附容量。4、離子交換劑的選擇和處理(1)選擇：如前所述，離子交換劑由基質(zhì)和帶電的基團(tuán)構(gòu)成，常用的有DEAE和CM，前者為弱陰型，后者為弱陽型。常用的離子交換劑，既有陰、陽離子之分，也有強(qiáng)、弱之別。因此，應(yīng)根據(jù)純化蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)及結(jié)構(gòu)，決定離子交換劑以及相應(yīng)的淋洗條件的選擇；如使用陰離子交換劑，則所應(yīng)用的pH值應(yīng)高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，以使蛋白質(zhì)呈陰離子性．反之亦然。此外，弱離子交換劑用于分離對(duì)電荷具有高親和力的蛋白質(zhì)，而強(qiáng)離子交換劑則用于分離對(duì)電荷具合較低親和力的蛋白質(zhì)(表8-11)。不過，一般不推薦使用強(qiáng)陽或強(qiáng)陰型離子交換劑，田其有導(dǎo)致蛋白變性之慮。

離子交換刑的吸附能力(即樣品的負(fù)載量)取決于離子交換基團(tuán)的含量。離子交換基團(tuán)愈多，交換量愈大，吸附容量亦愈大。通常，上樣量在離子交換劑交換容量的5％以下時(shí)，可獲得較好的分離效果。但是，如考慮進(jìn)行制備型分離，則可不受此限。(2)處理：

處理纖維素離子交換劑時(shí)，一般允將所需量的交換劑輕輕加入0.5mol／LNaOH溶液中，略加攪拌，待其自然沉降，室溫靜置30min后去除上清液。然后按0.5mol／LNaOH-0.5mol／LHCl-0.5mol／LNaOH順序處理。每次更換前，需用蒸餾水充分洗滌至中性，CM纖維素和微粒型纖維素在堿洗時(shí)不易沉降，可加用0.5mol／LNaCl。葡聚糖制劑不需酸和堿處理，使用時(shí)將葡聚糖凝膠放于PBS緩沖液膨脹1—2d(室溫)，或在中性溶液中煮沸2h，在處理過程中，避免強(qiáng)烈的攪動(dòng)，以避免圓珠結(jié)構(gòu)受損，但不需除去細(xì)粒。（四）親和色譜1、原理親和色譜是利用生物分子間的專一性識(shí)別能力、即它們之間所具有的親和力而設(shè)計(jì)的色譜技術(shù)：如抗原、半抗原與其抗體、蛋白A和一些抗體之間，均具有專一性的親和力，在一定條件下能緊密結(jié)合成復(fù)合物，而這種結(jié)合又是可逆的，改變條件可將它們解離。當(dāng)把可結(jié)合的一對(duì)分子的一方（例如抗原）作為配基，通過一定的化學(xué)修飾及偶聯(lián)反應(yīng)．將其固定化于惰性載體上，便制出了親和填料，亦即親和介質(zhì)（圖8-4）。有時(shí)因?yàn)榭臻g位阻效應(yīng)的存在，使得被分離物難以接近固定化的配基．以致會(huì)降低樣品的負(fù)載量。親和介質(zhì)示意圖

載體空間臂配基配原

為此，可以在載體和配基之間連接一個(gè)適宜長(zhǎng)度的分子鏈段，稱為空間臂。將制得的親和介質(zhì)填裝成親和色譜柱，以適宜的緩沖液為流動(dòng)相，并令親和介質(zhì)的對(duì)應(yīng)物（如抗體）隨流動(dòng)相流過該色譜柱，則會(huì)因抗原-抗體的親和相互作用，使抗體被吸附于親和介質(zhì)上。此時(shí)，與該介質(zhì)沒有親和相互作用力的其它物質(zhì)，隨流動(dòng)相一起被沖出色譜柱。改變流動(dòng)相的組成或淋洗條件，可以將（固定化的）抗原-杭體復(fù)合物解離，收集其流出液，便可以得到已純化的抗體。從上述親和色譜的原理可知，它具有極高的選擇性。有時(shí)甚至可以僅用一步分離，便可得到純度很高的產(chǎn)品。親和力一對(duì)親和物質(zhì)的親和力，可以用親和常數(shù)，即結(jié)合常數(shù)來表示，用于親和色譜時(shí)，這一常數(shù)不宜過高或過低。過高，則難以洗脫。過低，則因?qū)Ｒ恍圆疃x擇性不佳。親和力常數(shù)一般在103-108之間。2、載體的選擇

使配體固相化的不溶性化合物稱為載體。用于親和色譜的理想載體應(yīng)該具備下述特性：①高度親水，使固相配體易于同水溶液中的相應(yīng)結(jié)合物接近；②惰性載體，使載體的非專一性吸附盡可能小；③具有相當(dāng)量的化學(xué)基團(tuán)可供活化，并在溫和條件下能與較大量配體連接；④有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性，不易受周圍條件(如pH、離子強(qiáng)度、溫度、變性劑和去污劑等)的影響；⑤具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過而增加配體的有效濃度；⑥有良好的機(jī)械性能，利于控制色譜速度，最好是均一的珠狀顆粒?？墒褂玫哪z的種類

凝膠色滯中所使用的各種凝膠，均可作為親和色譜的載體。抗體純化中常用的載體為瓊脂糖凝膠，它是球狀凝膠顧粒、球狀瓊脂糖凝膠親水能力很強(qiáng)，物理和化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定。交聯(lián)型凝膠，即機(jī)械強(qiáng)度較高的硬膠和半硬膠、在制備型抗體分離上有其特點(diǎn)。它們可以使用較高的流速，從而可以得到較高的制備效率，也縮短了制備生產(chǎn)的周期。膜為載體的膜親和色譜應(yīng)用：所使用的膜材料可以是微濾膜也可以是超濾膜；既可用合成的分子膜，也可用濾紙等天然材料將數(shù)層膜疊合起來制成膜色譜柱。3、配體的選擇

在抗體的純化中，既可以使用該抗體的抗原，也可以利用該抗體的有關(guān)特性去制備或?qū)ふ疫m合的親和配體。抗原的類似物也可以用作為配基，盡管它們與抗體的親和力一般較小，但選擇適宜的條件，依然可以得到很好的分離效果；此外，固定化金屬離子親和色譜、以組氨酸為配基的親和色譜以及利用親和標(biāo)簽等方法，均可進(jìn)行抗體的親和色譜分離。(1)抗原：

根據(jù)抗原和抗體能形成抗原-抗體復(fù)合物的特性，發(fā)展了免疫親和色譜。將可溶性抗原用化學(xué)方法偶聯(lián)到不溶性載體(如sepharose4B)上，使之固相化，并填裝入適宜的色譜柱中，將相應(yīng)的抗血清加入柱中，抗血清中相應(yīng)的抗體就與抗原特異結(jié)合，其它蛋白成分隨洗液流出。改變緩沖液的pH和離子強(qiáng)度，就可以使抗體和偶聯(lián)在載體上的抗原分開而被洗脫下來，從而得到純凈的抗體。(2)蛋白A：

蛋白A是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的一種蛋白成分，它是單一的多肽鏈，分子量為42000，分為5個(gè)片段。從N末端開始有4個(gè)由58-62個(gè)氨基酸殘基組成的高度同源的片段，每個(gè)片段都具有和IgG的Fc段結(jié)合的活性。但是，就整個(gè)蛋白A分子而言，只能與2個(gè)Fc段結(jié)合，這種結(jié)合是一種疏水性作用。改變pH、鹽濃度或加入有機(jī)溶劑，則可以將IgG從蛋白A洗脫下來。蛋白A具有良好的再生性，耐受低pH反復(fù)處理的性能極佳，并可采用高濃度的諸如尿素、鹽酸胍或異硫氰酸鉀等變性劑進(jìn)行處理而不致受到破壞，大多數(shù)抗體都能耐受短暫的低pH處理。(3)蛋白G：

蛋白G是鏈球菌表面的一種蛋白，分子量為30000-35000，它對(duì)免疫球蛋白的吸附機(jī)制與蛋白A相似。蛋白G對(duì)各種免疫球蛋白的吸附能力與蛋白A不同．故在抗體的純化上可與蛋白A互補(bǔ)。當(dāng)某些抗體對(duì)蛋白A沒有吸附能力時(shí)，它們往往會(huì)對(duì)蛋白G有吸附作用(表8-12，8-13)。(4)蛋白L：

蛋白L是從厭氧鏈球菌細(xì)胞表面分離出來的一種蛋白質(zhì)，分子量約72000。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，它可以專一地與κ鏈相結(jié)合。但是，它與λ鏈的結(jié)合力卻很弱。經(jīng)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，也并不是所有的κ都和蛋白L有親和力，VκI亞群、VκIII亞群可以和蛋白L結(jié)合，而VκII亞群及λ輕鏈的所有亞群則否。此外，蛋白L也能識(shí)別大鼠、小鼠、免和靈長(zhǎng)類的κ鏈。這樣，就有可能利用蛋白L為配基，以親和色譜去分離人鼠雜交抗體和重組的小抗體片段。(5)蛋白H：

蛋白H也是一種由鏈球菌(APl株)產(chǎn)生的表面蛋白。與前面介紹的幾個(gè)蛋白不同的是，蛋白H與免疫球蛋白的結(jié)合具有溫度依賴性。在22度時(shí)發(fā)生結(jié)合，盯在37度時(shí)則解離。它能以很高的親和力與人IgGl-IgG4、人IgGFc以及免IgG相結(jié)合。但是，不與人IgA、1gD、IgE、IgM以及大鼠、小鼠、牛、綿羊和山羊的IgG相結(jié)合。蛋白H具有很強(qiáng)的種屬專一性和溫度依賴性。很溫和的條件下，利用蛋白H去純化重組人單抗及其片段。(6)組氨酸：

早在10年前便已發(fā)現(xiàn)，以組氨酸為配基的親和色譜，可用以分離IgG。關(guān)于組氨酸與IgG之間的親和力，不同條件下有所差異。與組氨酸之間的親和作用力恰好適于親和色譜的要求。是一種簡(jiǎn)單、有效、方便、價(jià)廉的分離純化IgG的親和色譜配基。組氨酸可以固定于任何載體上，例如：常用凝膠、交聯(lián)凝膠、高效凝膠、中空纖維以及其他膜材料上，非常適合制備分離之用。(7)固定化金屬離子：

利用帶有整合基團(tuán)的凝膠或樹脂，將金屬離子以整合作用吸附或固定于其上。固定化的金屬離子能和蛋白質(zhì)分子鏈上的一些殘基，如組氨酸相互作用，產(chǎn)生親和作用力而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。這種方法被稱為固定化金屬離子親和色譜（IMAC)或稱為金屬整合親和色譜(MCAC)。

IMAC中常用的整合基團(tuán)有亞胺基二乙酸基(IDA)和亞胺基二乙醛基(IDAD)等；常用的金屬離子有Zn2+、Ni+

、Mg2+、Cu2+等；可以選用任何載體以制備親和色譜柱。

為進(jìn)一步增強(qiáng)分離的效果，可以在設(shè)計(jì)重組抗體時(shí)，在抗體鏈段的N端或C端融合上一串寡聚組氨酸鏈（6His，4His等），就像給重組抗體加上了一個(gè)標(biāo)簽(tag)。這樣，便可以用IMAC柱子(帶有His的融合蛋白一般用鎳柱純化)很方便地將融合蛋白分離出來；得到的融合蛋白再以適當(dāng)方法去掉寡聚組氨酸，就能回收純化的蛋白。這種方法簡(jiǎn)單、有效，運(yùn)用得當(dāng)時(shí)，可收到很好的效果。（如果要去掉His，采用FactorXaProtease酶解即可）（五）高效液相色譜

前述各種色譜模式，已在生化實(shí)驗(yàn)室中獲得了廣泛的應(yīng)用。但是，人們常為柱色譜(層析)的費(fèi)時(shí)和低效而苦惱，通過色譜基本理論的研究可知，在填充色譜柱中，填料粒徑、形狀以及填充柱床緊密程度的不均一性，都會(huì)對(duì)色譜柱的性能產(chǎn)生影響。這些效應(yīng)對(duì)柱子理論塔板高度的影響，與填料顆粒的粒徑及粒徑分布密切相關(guān)。粒徑大時(shí)柱效低；粒徑小則柱效高；此外，填料顆粒的粒徑分布均勻時(shí)，柱效也相應(yīng)會(huì)高一些。因此，為提高柱效，應(yīng)使用細(xì)粒徑的填料，并要求填料的粒徑分布盡可能地均勻，甚至使用粒徑單分散的填料。正是基于這樣的原理，在20世紀(jì)70年代出現(xiàn)了以使用細(xì)粒徑填料為特征的高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)。高效液相組成示意圖12345輸液系統(tǒng)2進(jìn)樣系統(tǒng)3色譜柱4檢測(cè)器

5數(shù)據(jù)處理及控制系統(tǒng)灌流色譜在灌流色譜的填料上，既有50-150um的微孔，又有貫穿整個(gè)顆粒的600-800um的超大孔存在，允許流動(dòng)相直接進(jìn)入填料顆粒內(nèi)部貫穿而過。柱子通透性很好，高流速條件下也不需要增加工作壓力。因此該種色譜柱同時(shí)具有高流速、高效率、高樣品負(fù)載率和低操作壓力（poros柱）。灌流色譜填料示意圖擴(kuò)散孔貫穿孔第二節(jié)抗體的測(cè)定

抗體的測(cè)定．包括抗體純度、含量、抗體活性、抗體特異性以及抗體親和力的測(cè)定等幾個(gè)方向。這些指標(biāo)與參數(shù)對(duì)抗體的研究與應(yīng)用均十分重要．特別是近年來，隨著越來越多的治療用抗體進(jìn)入臨床，必須嚴(yán)格地控制抗體制品的純度、含量和活性等指標(biāo)。同時(shí)，對(duì)與其相關(guān)的其它一些參數(shù)，也需要加以測(cè)定。常用的方法．如RIA和ELISA等已很成熟。但是，這些方法往往較為煩瑣是需較多的時(shí)間并難于測(cè)定動(dòng)態(tài)的過程。因此，需要發(fā)展簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、方便、快速和動(dòng)態(tài)的檢測(cè)新方法。新的方法中，最引入注目的是基于表面等離子體共振的“生物相互作用體系”

(BIAcore)；利用BIAcore，可以快速、準(zhǔn)擊、靈敏、方便、及時(shí)地測(cè)定抗原—抗體相互作用的動(dòng)態(tài)過程。相對(duì)于常規(guī)的酶聯(lián)免疫和放射免疫等方法，這無疑是一個(gè)巨大的進(jìn)步。一抗體特異性的測(cè)定

抗體的特異性，指的是一種抗體識(shí)別只有不同結(jié)構(gòu)抗原的能力?；蛘哒f,一種抗體僅與具有特定分子結(jié)構(gòu)的抗原才發(fā)生明顯的分子識(shí)別作用。一般情況下，抗原與抗體之間的特異性相互作用，發(fā)生于抗原上的抗原決定簇與抗體上的抗體結(jié)合部位之間。而當(dāng)其它某種分子也具有類似結(jié)構(gòu)時(shí)，它也能與抗體發(fā)生類似的分子識(shí)別作用，這就是交叉反應(yīng)(crossreaction)。

抗體的特異性是決定抗體應(yīng)用價(jià)值的關(guān)鍵，可以用多種力法進(jìn)行測(cè)定，其基礎(chǔ)均是利用了抗原—抗體特異性相互作用；這種測(cè)定可以通過沉淀、凝集等作用的直接觀察進(jìn)行．但往往靈敏度較低。近年來，一些新的儀器和方法，如酶免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)；以及表面等離了體共振(SPR)和石英晶體微天平(QCM)等．被用于直接測(cè)定抗體的特異性，靈敏度可達(dá)到ug／m1或更低。

本節(jié)僅介紹酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、放射免疫測(cè)定（RIA）、免疫熒光測(cè)定三種方法。（一）ELISAELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。

原理：ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體─聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測(cè)抗體的間接法、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法ELISA圖8-9酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA

底物酶標(biāo)抗體Ab（待測(cè)）AgELISA常用的酶和底物辣根過氧化物酶，底物為OPD,深桔黃色，檢測(cè)波長(zhǎng)492nmTMB，藍(lán)綠色，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm

堿性磷酸酶，底物為PNPP（對(duì)－硝基苯磷酸酯）,黃色檢測(cè)波長(zhǎng)405nm

ELISA各步驟的反應(yīng)時(shí)間

包被：24－36h，蛋白濃度為1－5ug/ml

封閉：37oC2h或4oC過夜（3％BSA）樣本反應(yīng)時(shí)間：37oC45min-1h

酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間：37oC45min-1h

顯色時(shí)間：15min(避光）設(shè)對(duì)照可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?/p>

辣根過氧化物酶標(biāo)記方法酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用過碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結(jié)合。后者可進(jìn)一步用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。ELISA常規(guī)生色底物辣根過氧化物酶底物：ABTS水溶性HRP底物，在過氧化物酶的作用下產(chǎn)生綠色終產(chǎn)物。該綠色產(chǎn)物在410nm及650nm具有兩個(gè)主要的吸收峰。OPD和HRP反應(yīng)時(shí)生成桔黃色的產(chǎn)物，在492nm時(shí)吸收最大。OPD易溶于底物緩沖液，如StablePeroxidaseSubstrateBuffer。TMB被過氧化氫氧化時(shí)（由HRP催化）可形成藍(lán)色產(chǎn)物，主要吸收峰在370nm和652nm。加入硫酸或磷酸后，它會(huì)變成黃色，最大吸收峰為450nm。TMB靈敏度很高，達(dá)到相同的檢測(cè)靈敏度需要的量比ABTS少，但這也可能產(chǎn)生較高的背景，所以要求使用較少的蛋白或較低的抗體濃度。堿性磷酸酶色底物PNPP堿性磷酸酶和PNPP反應(yīng)后，形成黃色水溶反應(yīng)產(chǎn)物，該產(chǎn)物在405nm處有光吸光。半乳糖苷酶底物ONPGONPG是一種卓越的b-半乳糖苷酶底物。該產(chǎn)品完全可溶，并且在450nm具有高的消光系數(shù)。它產(chǎn)生一種黃色產(chǎn)物，用1M碳酸鈉終止后在可見光范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。2類型（1）間接法測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體，檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。常用于臨床血清中自身抗體的檢測(cè)，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測(cè)。方法：抗原包被封閉待檢抗體洗滌酶標(biāo)二抗洗滌顯色反應(yīng)終止反應(yīng)ELISAReader檢測(cè)OD值(2)雙抗體夾心法測(cè)抗原是檢測(cè)抗原最常用的方法。

只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。常用的組合：?jiǎn)慰寺】贵w＋多克隆抗體單克隆抗體＋單克隆抗體后一組合是兩種單克隆抗體針對(duì)抗原上不同的相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。用途：測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測(cè)。雙抗體夾心法測(cè)抗原的方法：捕獲抗體包被封閉（3％BSA）待測(cè)抗原洗滌（含0.1％Tween的PBS)酶標(biāo)單抗或多抗洗滌顯色檢測(cè)1）抗體固相測(cè)抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。方法：抗體包被封閉同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原洗滌酶底物顯色ELISAreader檢測(cè)(3)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原2）抗原固相測(cè)抗原其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。標(biāo)本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，最后的顯色也愈淺。方法:a:抗原包被96孔板；b:封閉;c:待測(cè)抗原與抗體反應(yīng)一定時(shí)間；d:加入96孔板

e:洗滌f：加入酶標(biāo)二抗

g：洗滌h：顯色和檢測(cè)如臨床血清樣本的檢測(cè)以及細(xì)胞培養(yǎng)上清的檢測(cè)（4）IgM抗體的檢測(cè)1）間接法：間接法ELISA一般僅適用于檢測(cè)總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定血清中的IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結(jié)合到固相上，將出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，如果用抗IgM作為二抗，間接測(cè)定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。方法

a:抗原包被96孔酶標(biāo)板；b:封閉;c:待測(cè)血清與A蛋白反應(yīng)一定時(shí)間后離心

d:吸取上清液加入96孔酶標(biāo)板

e:洗滌f：加入酶標(biāo)抗IgM的抗體

g：洗滌h：顯色和檢測(cè)（5）ABC-ELISA技術(shù)