分子生物學第08章PCR-聚合酶鏈反應(yīng)

8.1PCR的基本原理8.2PCR條件的優(yōu)化8.3由基本PCR擴展的相關(guān)技術(shù)及其應(yīng)用8PCR－聚合酶鏈反應(yīng)PCR的特點

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerasechainreaction，PCR）是一種體外擴增DNA片段的方法，與用載體和宿主細胞的體內(nèi)擴增相比，有簡便、快速的優(yōu)點，并有許多特殊的用處。PCR的基本原理一PCR的基本原理二圖8－1PCR的基本原理PCR反應(yīng)的體系DNA模板一對引物耐熱的DNA聚合酶4×dNTP緩沖液Mg2+、K+離子酶活性保護劑PCR儀

PCR儀實際上就是一種溫度循環(huán)儀，它能夠快速地升降溫和保持恒溫，全部由電腦控制。常用的反應(yīng)容器有0.2ml的薄壁Eppendorf管和毛細玻璃管。對DNA模板的要求

對DNA模板純度的要求不很高，但必須除去DNA聚合酶抑制劑。理論上有一個DNA模板分子就可以擴增出大量的產(chǎn)物，實際上使用pg~ng級的模板量。模板一般是雙鏈分子，也可以是單鏈分子。模板DNA分子不宜太長，可用切點稀少的限制酶切成較短的片段。由于環(huán)狀DNA模板的擴增效率較線狀DNA模板低，所以最好先將環(huán)狀DNA用限制酶切成線狀再行擴增。RNA模板應(yīng)先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行PCR擴增。引物長度一般為15~30個核苷酸。引物太短與模板結(jié)合的位點特異性差，引物太長與模板結(jié)合的速率下降，影響PCR的效率。不應(yīng)有超過3個連續(xù)的C或G。引物自身不存在互補序列，兩個引物之間也不能有超過4個連續(xù)堿基互補的情況。當引物的3’端有足夠長與模板互補的序列時，引物的5’端可以不與模板互補，利用這點可在PCR產(chǎn)物的兩端加上特殊序列（如限制性內(nèi)切酶位點）。圖8－2引物5’端外加BamHⅠ酶切

位點摻入產(chǎn)物的兩端引物為了方便PCR產(chǎn)物的檢測和分析，可以在引物的5’端以同位素或非同位素修飾（32P、熒光素、生物素等）。當要擴增的DNA序列不知，但知其編碼的氨基酸序列，可反推出DNA序列，為設(shè)計引物提供依據(jù)。因簡并密碼的存在，反推出的DNA序列是不唯一的，這時應(yīng)采用簡并引物。表8－1引物5’端修飾技術(shù)修飾法用途修飾法用途1.附加核酸序列2.功能基因修飾酶切位點便于克隆等同位素(35S,32P)檢測，定量噬菌體啟動子測序，合成RNA探針等生物素檢測，純化，定量蛋白質(zhì)結(jié)合序列產(chǎn)物純化，檢測熒光素檢測，純化酶檢測TaqDNA聚合酶

現(xiàn)在常用的Taq酶，在95℃的變性溫度下（20秒），經(jīng)過50次循環(huán)仍保持65%的酶活性。對于Taq酶的聚合酶活性來說，最佳作用溫度為75~80℃，60℃時聚合酶活性僅剩1/2，37℃時聚合酶活性僅剩1/10。但在許多情況下，需要在低于最適溫度條件下進行聚合反應(yīng)，以免引物從模板上解離下來。TaqDNA聚合酶

Taq酶有5’→3’的聚合活性和5’→3’的外切活性，但缺少3’→5’的外切活性，所以沒有校正功能，有時會發(fā)生錯誤合成。使用Taq酶還往往在所有擴增產(chǎn)物的3’端增加一個非模板依賴的A?，F(xiàn)在作為商品供應(yīng)的Taq酶有從嗜熱水生菌中提純的天然酶和利用大腸桿菌生產(chǎn)的基因工程酶。

PCR的反應(yīng)體系

PCR中常用的緩沖液是10～50mmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH8.3～8.9，還需要合適的Mg2+濃度（約1.5mmol/L）和K+濃度（50mmol/L），其中Mg2+濃度須經(jīng)過預(yù)備實驗確定合適的值，在0.05mmol/L和5mmol/L之間試驗，按每0.5mmol/L增加。Mg2+濃度太高時非特異擴增增加，太低時產(chǎn)物減少。PCR的反應(yīng)體系

Taq酶的用量必須適當，一般典型的擴增反應(yīng)加2單位的酶，太高非特異擴增增加，太低時擴增效率下降。4種dNTP的濃度應(yīng)相等，濃度在20～200μmol/L之間。反應(yīng)體系中加入BSA或明膠可以保護Taq酶活性。在無熱蓋的PCR儀上，反應(yīng)液表面應(yīng)加礦物油以阻止蒸發(fā)。循環(huán)條件的設(shè)定變性---------→退火----------→鏈延伸循環(huán)變性退火鏈延伸首輪循環(huán)94℃5min50℃2min72℃3min中間循環(huán)94℃1min50℃2min72℃3min末輪循環(huán)94℃1min50℃2min72℃10min循環(huán)條件舉例循環(huán)條件的設(shè)定

在循環(huán)溫度的設(shè)定中，最重要的是退火溫度。退火溫度較低可提高擴增效率，但產(chǎn)物的特異性較差；退火溫度較高可提高產(chǎn)物的特異性，但擴增效率較低。嵌套PCR(nestedPCR)嵌套PCR提高產(chǎn)物特異性的原理單用第一對引物擴增，得一特異性產(chǎn)物和一非特異性產(chǎn)物。單用第二對引物擴增，得一特異性產(chǎn)物和一非特異性產(chǎn)物。以第一對引物擴增的產(chǎn)物為模板，用第二對引物再次擴增，只得到特異性產(chǎn)物。特異性產(chǎn)物特異性產(chǎn)物非特異性產(chǎn)物非特異性產(chǎn)物反向PCR(invertedPCR)錨式PCR(anchoredPCR)RACERapidAmplificationofcDNAEnds擴增mRNA3’端或5’端的序列稱為RACE。錨式PCR擴增已知序列3’側(cè)序列錨式PCR擴增已知序列5’側(cè)序列錨式PCR擴增全長的mRNA序列

要擴增全長的mRNA，先用oligo(dT)作引物逆轉(zhuǎn)錄該mRNA成全長的cDNA第一鏈，再給cDNA第一鏈的3’端進行同聚物加尾（如GGGGG），最后用oligo(dT)和oligo(dC)進行擴增。

不對稱PCR(asymmetricPCR)定量PCR

嚴格地掌握實驗條件，使PCR擴增產(chǎn)物量與模板量成正比。這樣可將痕量的模板擴增后檢測，從而得到原模板的量。此法常用于低豐度mRNA的檢測。先將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板擴增出產(chǎn)物，檢測產(chǎn)物的量從而推算出低豐度mRNA的量。這種方法稱為反轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR）。(quantitativePCR)定量PCR中的內(nèi)標

由于影響擴增產(chǎn)量的因素較多，模板與擴增產(chǎn)物量的比例關(guān)系難以確定，所以必須在同一次PCR中加入內(nèi)標。在一次PCR中同時加入兩種模板，一種是待測模板，另一種是按確定量加入的作為內(nèi)標的對照模板，二者使用相同的引物，對照模板與待測模板的差異應(yīng)盡量小，以便最大程度地減少擴增效率的系統(tǒng)誤差。對照模板擴增產(chǎn)物和待測模板擴增產(chǎn)物必須能由電泳分辨出來，比如二者的分子量有一定的差異，或是二者序列中有限制酶切位點的差異。

熒光定量PCR

1995年美國PerKinElmer公司研制成功具有革命性意義的熒光定量PCR技術(shù)，它融合了PCR高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點。熒光定量PCR是直接探測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測，完全閉管操作，在整個過程中，僅有加入樣品的一次開蓋。

TaqMan熒光探針（線性探針）在PCR擴增體系中加入一個特異性的、能與PCR產(chǎn)物中部雜交的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團（R）和一個熒光淬滅基團（Q）。探針完整時，R基團發(fā)射的熒光信號被Q基團吸收，結(jié)果是沒有熒光出現(xiàn)。PCR擴增時，Taq酶的5’→3’外切活性將探針酶切降解，使R基團與Q基團分離，Q基團對R基團的熒光淬滅作用消失，于是產(chǎn)生熒光信號。每擴增一條DNA鏈，就有一個R基團分離，游離的R基團數(shù)量（也就是熒光強度）與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。通過檢測熒光強度的變化，機內(nèi)的電腦可以計算并直接給出初始模板的數(shù)量。

TaqMan熒光探針工作原理分子信標（環(huán)狀探針）分子信標熒光探針的設(shè)計與TaqMan熒光探針相似，只不過探針的5’端和3’端的一小段序列被設(shè)計成互補的，探針沒有與靶序列雜交時會形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，R基團和Q基團靠近，不能產(chǎn)生熒光。當分子信標與靶序列雜交時，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被展開，使得R基團和Q基團分開足夠遠，Q基團對R基團的熒光淬滅作用消失。余同前。SYBR熒光染料在PCR反應(yīng)體系中，加入過量的SYBR熒光染料，SYBR熒光染料能特異性地摻入DNA雙鏈中，產(chǎn)生熒光信號，而不摻入DNA雙鏈中的SYBR熒光染料不會發(fā)出熒光。這樣熒光強度就與雙鏈DNA的量成正比。

熒光定量PCR儀光路圖PCR產(chǎn)物與載體的連接解決辦法：用T4DNA聚合酶除去PCR產(chǎn)物3’端多余的核苷酸，成為平端后連接。給平端