哺乳動物RNA提取

脯乳動物RNA提取主講：劉玉潔AAAAAAtRNAmRNArRNARNase不同豐度組織名稱樣品量總RNA含量高豐度肝臟1mg2-4μg脾臟1mg心臟1mg中豐度大腦1mg0.05-2μg胚胎1mg腎臟1mg肺1mg低豐度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高豐度成纖細胞1050.5-1μg人白細胞105中豐度酵母1050.5-1.5μg擬南芥葉片1mg0.2-0.5μg低豐度煙草葉片1mg0.05-0.1μg玉米葉片1mgAAAAAA關于RNA的分布

總RNA

真核細胞的RNA主要分為：

1、mRNA:1-5%

起始密碼：AUG終止密碼：UAA,UAG,UGA。

5`鳥嘌呤7位甲基化—CH3修飾。

1）免受核酸酶破壞，

2）起始、促進蛋白質合成。

3`poly(A)尾巴結構20--200個A.翻譯所必需。

2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%

大亞基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt

小亞基40S:18S=1874nt方法1.異硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）2.胍鹽/β-巰基乙醇法適用于大部分動植物材料，但對于次生代謝產(chǎn)物較多的植物材料提取RNA效果較差適用于各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料3.沉淀法4.介質吸附：硅介質·陰離子交換樹脂·磁珠原理1RNase抑制

因RNA分子較小，不易被機械張力拉斷，但極易被RNase降解，故而在提取過程中對RNase的抑制尤為重要。故過程中必須添加RNase抑制劑。如DEPC，異硫氰酸胍等。(RNase:核糖核酸酶)ABC破碎組織提取純化

鑒定分析破碎組織使用高濃度變性劑TRIZOL，可溶解蛋白質，破壞細胞結構，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶得到RNA,DNA,蛋白質，細胞碎片TRIZOL的組成※苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質解聚得到釋放?！?.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強抑制作用?！惲蚯杷犭覍儆诮馀紕?，是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質并使蛋白質二級結構消失，導致細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離?！?巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。提取純化苯酚氯仿異丙醇乙醇DNA，蛋白質沉淀到有機相RNA留在水相釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離提取核酸沉淀RNA洗滌RNA鑒定分析1·瓊脂糖電泳檢測：觀察到RNA帶2·核酸濃度儀檢測（紫外光吸收法）：濃度=稀釋倍數(shù)×讀數(shù)純度：OD260／OD280=1.8~2.01.電泳：溶液中帶點顆粒在電場中朝著與其自身所帶電荷相反的方向移動的現(xiàn)象。利用各RNA分子（帶負電荷）在電場中移動速率的差異對其進行鑒定。其速率與帶電量成正比，與分子大小成反比。2.核酸、核苷酸及其衍生物的分子結構中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng)(－C＝C一C＝C一)，能夠強烈吸收250~280nm波長的紫外光。核酸的最大紫外吸收值在260nm處。遵照Lambert-Beer定律，可以從紫外光吸收值的變化來測定核酸物質的含量。OD260=1,RNA=40μg／mlOD260／OD280小于1.75有蛋白質或酚污染大于2.0有DNA污染提取方法2（一）準備工作RNase酶非常穩(wěn)定，是導致RNA降解最主要的物質。它在一些極端的條件可以暫時失活，但限制因素去除后有迅速復性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上。因此，在進行與RNA有關的實驗時，必須戴手套。RNase的另一污染源是取液器，一般情況下用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部即可。料制品的處理：盡可能使用無菌、一次性的塑料制品玻璃和金屬物品的處理：250°C烘烤3小時以上（二）試劑準備

1．TRIzol試劑2．氯仿3．異丙醇4．75%乙醇（0.1%DEPC配制）5．無RNase的水或0.5℅SDS（0.5%SDS溶液必須用由DEPC預處理、高壓滅菌的水）6.取新鮮小鼠肝臟組織，組織塊不宜過大,放在玻片上立即研磨,研磨要徹底。研磨后的組織（小米粒大?。ㄈ┎僮鞑襟E1.細胞懸液，離心收集細胞，每5~10×10?動物細胞要加入1mlTRIzol，反復吸打。加入TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。2.將勻漿樣品在室溫（15~30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。3.加入0.2ml氯仿，輕微振蕩15秒（避免蛋白質和DNA脫離導致DNA釋放到水相中），室溫靜置3分鐘。4.于2~8℃，12000r/min離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。

RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。5.把水相轉移到新管中（如要分離DNA和蛋白質可保留有機相），用異丙醇沉淀水相中的RNA。加入0.5ml(1mlTRIzol)異丙醇，室溫靜置10分鐘。6.于2~8℃，12000r/min離心10分鐘。離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，去上清。7）加1ml75%乙醇洗滌。8）7500rpm，4C離心1min，棄上清再離心幾秒鐘，將管壁液體完全移凈。在用TriZol試劑提取總RNA時，全程均在室溫進行，當RNA沉淀用水溶解后，應該注意在冰上操作，而且盡可能快地進入下一個環(huán)節(jié)。注意：75%乙醇的作用：不起沉淀作用，只是為了清洗管壁加入方法一定是貼管壁在沉淀的對側緩慢加入，不要攪動沉淀瓊脂糖電泳檢測凝膠的制備：用1×TAE電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠。樣品的制備與加樣：在超凈工作臺上，用移液器吸取總RNA樣品4μl于封口膜上。在實驗臺上再加入5μl1×TAE電泳緩沖液及1μl的10X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。電泳，染色及觀察：打開電源開關，調(diào)節(jié)電壓至100V，使RNA由負極向正極電泳，約30min后將凝膠放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測儀上觀察RNA電泳結果。核酸濃度儀檢測取潔凈離心管甲乙兩支，分別準確加入1.0mLRNA樣液，然后向甲管加入1.0mL蒸餾水，向乙管加入1.0ml過氯酸-鉬酸銨沉淀劑，搖勻后置冰箱內(nèi)30min，使沉淀完全。3000r/min離心10min，各吸取上清液0.5mL轉入相應的甲乙兩容量瓶內(nèi)，定容至50mL。以蒸餾水作空白對照，使用紫外光度計分別測定上述甲乙兩稀釋A260和A280的值。電泳結果A電泳時ladder扭曲BRNA帶缺失結果分析電泳時電壓過高電壓過高，電泳時間長，RNA跑出凝膠電泳時間短，分子大小相近的DNA段不易分辨（電泳）DRNA帶模糊ERNA帶弱或無C不規(guī)則RNA帶遷移電泳條件不合適RNA變性RNA變性或降解上樣量過多蛋白質污染緩沖液陳舊上樣量不足RNA降解讀數(shù)A260，A280.利用OD260=1時,RNA=40μg／ml計算RNA濃度計算OD260／OD280正常值應在1.8~2.0

小于1.75有蛋白質污染大于2.0有DNA污染結果分析（濃度儀）應用（mRNA）ART-PCR,Northern雜交，cDNA文庫構建B

mRNA末端快速擴增(RACE)，差異表達(DDRT-PCR)，引物延伸反應，體外轉錄RNA標記，RNA酶保護試驗，RNA微注射(RNAMicroinjection)A樣品量是否越多越好？問題討論A樣品量是否越多越好？問題討論答：不是。在試劑盒規(guī)定內(nèi)增加，若過度增加樣品處理量會影響RNA得率如增加樣品起始量，則后續(xù)實驗中各溶液量均要相應按比例增加。處理樣品量RNA得率實際得率預期得率最大量B如何保證研磨過程和勻漿中RNA不被降解？問題討論A如何保證研磨過程和勻漿中RNA不被降解？問題討論答：研磨過程要迅速，同時盡量避免外源RNA酶污染；勻漿過程中一定要保證組織和裂解液充分接觸，盡量在勻漿前將組織低溫切割成小塊加入裂解液中，可確保RNA不被降解。C如何保存提取出的RNA？問題討論C如何保存提取出的RNA？問題討論答：①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;②長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復合物)凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。DcDNA