植物mirna跨界研究項(xiàng)目建議書(shū)-deep sequencing project plant animal

Presentedby:ChunzhiJin,TechinicalSupportApril11,涉及到LCSciences的公司商業(yè)，請(qǐng)確保 內(nèi)容您個(gè)人科研使用，并承擔(dān)責(zé) 的內(nèi)容，根據(jù)國(guó)家有關(guān)法律、，LCSciences公司將有 大學(xué) miRNA的基本信息：microRNA(microRNA)是真核生物體內(nèi)一類具有 織特異性和發(fā)育階段特異性，通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合并剪切mRNA 或者抑制mRNA的翻譯從而 的表達(dá)。目前在miRbase（SangermiRbase18.0,2011-11-18）microRNA研究 庫(kù)中已有168個(gè)物種23215條microRNA成熟體 ，其中4677條microRNA是隸屬52種植物。這52種植物絕大多數(shù)可以作為食物供人類或者其他哺乳動(dòng)物食用，也有少數(shù)的中藥植物，如地黃（Rehmanniaglutinosa）。動(dòng)物體內(nèi)植物miRNA的研 ：2011年8月份 教授在Cell上EgestMacicytetsanLRP:evenefckgmgtnycR1Ra：cRA描述如下：“RA（cs）是一類長(zhǎng)度在t的非編碼RA，它產(chǎn)自其發(fā)夾前體，通過(guò)與靶的3’Rs區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)介導(dǎo)%的蛋白質(zhì)編碼的轉(zhuǎn)錄后沉默。McRAcRA的異常將會(huì)導(dǎo)cRcA表達(dá)譜可以作為以及其他一些的新的生物標(biāo)記。大量研究顯示特定的循環(huán)系統(tǒng)游離cRA面上的受體/配體，并且具有選擇性作用于靶細(xì)胞的功能。它能夠通過(guò)在細(xì)胞間生物活性油脂、A和其他囊泡結(jié)構(gòu)的組合體，而且許多的超微小泡包含著cRs。進(jìn)一步的研究表明，cRA可以選擇性的包入超微小泡，并且能夠自主的運(yùn)送到受體細(xì)胞，而外源性的cRs達(dá)體的能，泌cRs導(dǎo)胞訊號(hào)子種泌cRA重功有其研過(guò)現(xiàn)環(huán)cRA間和細(xì)胞器間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的新的研究領(lǐng)域。在張教授的研究中他們很驚奇的檢測(cè)到人類和哺乳動(dòng)物血漿內(nèi)的外源性植物cRA。大約半數(shù)的植物RA在和血漿的超微小泡Ra入到循環(huán)系統(tǒng)和不同的尤其是肝臟中，并且跨物種調(diào)控小鼠的低密度脂蛋白受體接頭蛋白LLRPmicroRNA可以通過(guò)食物進(jìn)入哺乳動(dòng)物腸道，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)以及肝臟中跨物種對(duì)哺乳動(dòng)物的mRNA進(jìn)行調(diào)控。miRNA的區(qū)別：microRNAmicroRNA都存在著很大的差異，植物microRNA在最后一個(gè)核苷酸的核糖上有一個(gè)天然的甲基化的羥基大大增加了植物microRNA分子的穩(wěn)定性。進(jìn)行miRNA 時(shí)，miRNA文庫(kù)構(gòu)建是利用到其在5‘端的磷酸基團(tuán)和3‘-羥基才能在兩端加上接頭，在接頭中引入引物進(jìn)而上機(jī)的。如圖，為哺乳動(dòng)物和植物microRNA的3‘末端最后一個(gè)核苷酸，植物microRNA的3‘端最后一個(gè)核苷酸的核糖上2‘-OH有一個(gè)甲基Me修飾變成2‘-OMe。microRNAmicroRNA3‘2‘-O-Me的存在而比哺乳動(dòng)物microRNA的的時(shí)候需要的時(shí)間。另外，哺乳動(dòng)物的microRNA由于不存在這個(gè)2‘-O-MemicroRNAmicroRNA建庫(kù)的過(guò)程中加入高碘酸處理而除去樣品中的哺乳動(dòng)物microRNA，僅對(duì)植物來(lái)源的microRNA在血中測(cè)些藥食的外性cR高的技會(huì)比cRA合適，除了新一代的高通量的技術(shù)具有極其深度的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍的優(yōu)勢(shì)可以檢測(cè)到個(gè)位數(shù)量級(jí)的表達(dá)量，能滿足低豐度外源性cA的檢測(cè)外，聯(lián)川生物技術(shù)公司研發(fā)人員對(duì) 的深入研究，特別對(duì)于某些特殊樣品尤其是血漿樣品的microRNA 了從RNA提取到小RNA建庫(kù)到數(shù)據(jù)分析過(guò)程中的一些改進(jìn)的策略。具體的說(shuō)，依據(jù)血血中可以檢測(cè)出的microRNA來(lái)作為RNA的質(zhì)控指標(biāo)，依據(jù)動(dòng)植物microRNA的是否有2’-Ome甲基修飾基團(tuán)，而在建庫(kù)策略里面進(jìn)行3’端接頭連接過(guò)夜的步驟，增強(qiáng)植物microRNA的 率，保留最多數(shù)的植物miRNA的檢出。此外，由于 、血漿中的存在的miRNA種類較少，并且無(wú)法用常規(guī)的電泳以及OD值檢測(cè)其RNA提取質(zhì)量。為了很好地檢測(cè) 、血漿樣品中可以檢測(cè)到的動(dòng)物microRNA（let-7a，miR423-5p，miR-21，hsa-miR-16，hsa-miR-103，hsa-miR-192，hsa-miR-93，hsa-miR-451），我們選擇其中部分作為提取RNA ，而外源性植物microRNA中可以選定miR168來(lái)作為質(zhì)控 ，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)定量這些質(zhì)控，從而判斷所提取的RNA是否保留有microRNA以及外源性的microRNA。此 、血漿本身的RNA就很少，所以采取富集性的提取小RNA，然后再建庫(kù)。通過(guò)上述針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)策略更好的進(jìn)行哺乳動(dòng)物體內(nèi)外源性植物（主要是中藥或者食物中）cR研究。數(shù)據(jù)分析cA殊樣品中的外源性RA ，血漿外，還可以增加肝臟，也即肝臟中也是存在外源性microRNA的，這也是一個(gè)很好的切入點(diǎn)。并且肝臟組織中的哺乳動(dòng)物microRNA還可以使用高碘酸氧化去除，僅對(duì)動(dòng)物樣品中植物microRNA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和研究。 存在植物性mcroRNA的哺乳動(dòng)物樣品，可以是血液，和血漿，最好是血漿，肝臟的可檢出microRNA進(jìn)行定量鑒定的RNA質(zhì)控步驟。對(duì)樣品分別進(jìn)行smallRNA文庫(kù)構(gòu)建，建庫(kù)過(guò)程中3‘端接頭連接過(guò)夜，保留植物性microRNA。而對(duì)于肝臟樣品，除了建庫(kù)過(guò)程中，3‘端接頭連接過(guò)夜，保留植物性microRNA，還可以選擇高碘酸處理過(guò)程，去除其中的哺乳動(dòng)物microRNA，進(jìn)而單純的對(duì)哺乳動(dòng)物肝臟中的植物microRNA進(jìn)行研究。smallRNAmiRbase版的所有植物已microRNA進(jìn)行零錯(cuò)配比對(duì)（零錯(cuò)配是為了增加研究結(jié)果的可靠性）。獲得樣品中的植物microRNA序列。microRNA在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的可能的靶，獲取這些microRNA在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮的功能信息。并且可以對(duì)不同處理樣品中的植物性microRNA表達(dá)量進(jìn)行差異比較。小貼和血漿RNA樣品和血漿樣品的microRNA表達(dá)譜分析雖然有廣闊的應(yīng)用前景，但仍需克服幾個(gè)難題才能確保實(shí)驗(yàn)成功進(jìn)行。首先，血漿 是無(wú)細(xì)胞樣品，RNA的含量很低。這意味著使用 yzer或OD值測(cè)定等普通的質(zhì)控方法并不適用于這些樣品其次，即使是從血漿或 中提取的最純的RNA也包含qPR反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄酶和Tq聚合酶抑制劑。最后，某些大RNA分子常用于PCR規(guī)范化，U6RNA，在 和血漿中的含量非常低。如何 血漿或中在選擇哪種樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，優(yōu)先選擇血漿，原因之一是血漿所用的采樣方法更加可靠。此外，血漿的q值稍低一些，說(shuō)明它的micrRNA含量更高。通常情況下，選取用檸檬酸或EDTA等抗凝劑的血漿樣品，因?yàn)檫@些血漿方法在后續(xù)的micrRNA表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)中能得到更好的結(jié)果。建議不要使用肝素抗凝血漿。正確收集和血液血漿血漿和的第一個(gè)步驟是全血。這個(gè)過(guò)程所的主要在于細(xì)胞RNA在體外的不穩(wěn)定性。文獻(xiàn)稱，在室溫下貯藏或時(shí)，全血中單個(gè)RNA種類（如mRNA）的拷貝數(shù)變化可能會(huì)超過(guò)1000倍。這是由RNA快速降解和抽血后某些特定的誘導(dǎo)表達(dá)共同造成的。RNA表達(dá)譜的這些變化使研究全血的表達(dá)變得不可能。雖然和血漿中的RNA種類相對(duì)來(lái)說(shuō)不受誘導(dǎo)表達(dá)的影響，它們?nèi)詴?huì)受到降解RNA酶的影響。因此，為了準(zhǔn)確分析血液血漿和中的表達(dá)，必須找到一種方法可以在全血過(guò)程中或之后保護(hù)RNA表達(dá)譜不受影響。通常，建議將全血立即制成或血漿。在從全血到和血漿的所有操作步驟中，應(yīng)采取措施防止細(xì)胞裂解，否則可能會(huì)導(dǎo)致和血漿完整細(xì)胞的RNA會(huì)掩蓋或 后續(xù)microRNA表達(dá)譜微小變化的檢測(cè)。在樣品 過(guò)程中，建議采樣過(guò)程使用詳細(xì)和固定的流程，避免這個(gè)步驟引入數(shù)據(jù)的技術(shù)變化。另外，樣品應(yīng)該在相近的條件下 - C。如果可以，應(yīng)盡快進(jìn)行RNA分離操作。延長(zhǎng)時(shí)間保存時(shí)，血漿 中的RNA通常在高于- 的溫度下比ZhangL,HouD,ChenX,LiD,ZhuL,ZhangY,LiJ,BianZ,LiangX,CaiX,YinY,WangC,ZhangT,ZhuD,ZhangD,XuJ,ChenQ,BaY,LiuJ,WangQ,ChenJ,WangJ,WangM,ZhangQ,ZhangJ,ZenKandZhangC-Y.ExogenousplantMIR168aspecificallytargetsmammalianLDLRAP1:evidenceofcross-kingdomregulationbymicroRNA[J].CellRes,2011,1-YuB,YangZ,LiJ,MinakhinaS,YangM,PadgettRW,StewardRandChenX.MethylationasaCrucialStepinPlantmicroRNABiogenesis[J].Science,2005