第5章表達(dá)載體2014

第五章表達(dá)載體第一節(jié)大腸桿菌表達(dá)載體第二節(jié)穿梭載體第三節(jié)整合載體表達(dá)載體構(gòu)建的一般原則1、閱讀框架要使目的基因得以表達(dá)，最重要的因素是外源目的基因本身必須置于正確的閱讀框架之中。用人工接頭可以調(diào)節(jié)閱讀框架，選擇適當(dāng)?shù)娜斯そ宇^，就可使外源基因處于正確的閱讀框架中。2、啟動(dòng)子（關(guān)鍵因素）有效的轉(zhuǎn)錄起始是外源基因能否在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)的關(guān)鍵步驟之一。

因此，選擇強(qiáng)的啟動(dòng)子及其相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)高效表達(dá)載體首先要考慮的問(wèn)題。3、轉(zhuǎn)錄的有效延伸和終止外源基因的轉(zhuǎn)錄一旦被起始，接下來(lái)的問(wèn)題是如何保證mRNA有效地延伸、終止。轉(zhuǎn)錄衰減和非特異性終止可誘發(fā)轉(zhuǎn)錄提前終止。措施：

（1）除去衰減子

（2）插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列

（3）強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列4、有效的翻譯起始（關(guān)鍵因素）原核：SD序列，能幫助從起始AUG處開(kāi)始翻譯。真核：kozak（科扎克）序列，核糖體能夠識(shí)別mRNA上的這段序列，并把它作為翻譯起始位點(diǎn)。5、翻譯終止密碼選擇在原核生物中，翻譯的終止由兩個(gè)釋放因子所控制，RF1識(shí)別UAA和UAG，RF2識(shí)別UAA和UGA。由于UAA為兩個(gè)釋放因子所識(shí)別，因此在基因工程中，一般采用UAA作為終止碼。6、外源蛋白的穩(wěn)定性可采取以下措施避免克隆的蛋白被選擇性降解：（1）構(gòu)建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白，使外源蛋白不被選擇性降解（2）構(gòu)建成可分泌的蛋白：不是所有的外源蛋白都可以通過(guò)基因操作成為可分泌蛋白。（3）使外源蛋白在宿主細(xì)胞中以包涵體的形式表達(dá)總之，構(gòu)建表達(dá)載體應(yīng)根據(jù)表達(dá)體系的特性，選擇性地應(yīng)用上述原則，刪除降低外源基因表達(dá)的一些元件，插入提高外源基因表達(dá)的一些必需元件。大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)

全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國(guó)FDA(美國(guó)食品藥物管理局)批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物第一節(jié)大腸桿菌表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)

缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類(lèi)繁多的內(nèi)毒素10一、大腸桿菌表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)

原核表達(dá)載體：適用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。均是質(zhì)粒載體，首先必然滿(mǎn)足克隆載體的基本要求，然后增加表達(dá)元件。111、表達(dá)元件(expressionelements)1）啟動(dòng)子(promoter)：三類(lèi)，即lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子和它們的雜合啟動(dòng)子tac或trc，都受IPTG誘導(dǎo)。T7噬菌體啟動(dòng)子λ噬菌體的PL啟動(dòng)子。2）終止子：依賴(lài)于ρ因子或不依賴(lài)于ρ因子（遇莖環(huán)結(jié)構(gòu)而終止）。3）核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomebindingside,RBS)：是mRNA上的特異性序列，核糖體可以識(shí)別并結(jié)合這一序列來(lái)啟動(dòng)翻譯過(guò)程。2、表達(dá)形式完整單一蛋白：?jiǎn)我换虻木幋a區(qū)表達(dá)。融合蛋白(fusionprotein)：多個(gè)基因的編碼區(qū)的串聯(lián)體，但構(gòu)成一個(gè)整體的單一ORF，如果融合標(biāo)簽蛋白有利于蛋白的定向、純化，如果融合多個(gè)目標(biāo)蛋白，則類(lèi)似于直接表達(dá)了一個(gè)多酶復(fù)合體一樣，可減少載體構(gòu)建難度，而且可以偶連兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)。12133、表達(dá)的控制誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)：IPTG防滲漏表達(dá)系統(tǒng)：lacIq，一種能產(chǎn)生過(guò)量的LacI阻遏蛋白（阻遏轉(zhuǎn)錄過(guò)程）的lacI

基因的突變體。PL啟動(dòng)子受cⅠ基因（阻遏溶菌周期基因表達(dá)）產(chǎn)物的抑制，在λ噬菌體溶原的大腸桿菌中表達(dá)。cⅠ基因的溫度敏感突變體cI857（ts）：低溫(30℃)下阻抑轉(zhuǎn)錄，高溫(40-45℃)下解除抑制。T7噬菌體啟動(dòng)子：較復(fù)雜二、利用T7噬菌體啟動(dòng)子的表達(dá)載體大腸桿菌T7噬菌體具有一套專(zhuān)一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱(chēng)為T(mén)7表達(dá)系統(tǒng)。14

T7表達(dá)系統(tǒng)T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。15T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理

T7噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄完全依賴(lài)于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式。

化學(xué)誘導(dǎo)型溫度誘導(dǎo)型雙質(zhì)粒系統(tǒng)T7RNA

聚合酶T7啟動(dòng)子目的基因

T7RNA聚合酶基因？啟動(dòng)子16化學(xué)誘導(dǎo)型噬菌體DE3是λ噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)acI啟動(dòng)子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其中。用噬菌體DE3的溶源菌作為表達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為化學(xué)誘導(dǎo)型，類(lèi)似于Lac表達(dá)系統(tǒng)。

T7RNA聚合酶基因

lac

啟動(dòng)子E.Coli（DE3）T7啟動(dòng)子

目的基因T7RNA

聚合酶IPTG誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)型

PL

啟動(dòng)子控制T7RNA聚合酶基因，通過(guò)熱誘導(dǎo)方式激發(fā)T7噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。

這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到很低的水平，尤其適用于表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質(zhì)。

T7RNA聚合酶基因

PL

啟動(dòng)子E.Coli（CE6）T7啟動(dòng)子

目的基因T7RNA

聚合酶熱誘導(dǎo)cI857雙質(zhì)粒系統(tǒng)

一個(gè)質(zhì)粒帶有T7RNA聚合酶基因，另一個(gè)質(zhì)粒帶有T7啟動(dòng)子和目的基因

兩個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標(biāo)記不能相同，調(diào)控方式為控制T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子調(diào)控類(lèi)型T7RNA

聚合酶熱誘導(dǎo)T7啟動(dòng)子

目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL

啟動(dòng)子

cI857

p15Aori

KanRColE1ori

AmpR19T7表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題

T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因的水平是目前所有表達(dá)系統(tǒng)中最高的，但也不可避免出現(xiàn)在相對(duì)較高的本底轉(zhuǎn)錄，如果目的基因產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌宿主有毒性，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。解決辦法在表達(dá)系統(tǒng)中低水平表達(dá)T7溶菌酶基因，能與T7RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性。通過(guò)共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)，它能明顯降低本底轉(zhuǎn)錄。20表達(dá)融合蛋白有下列優(yōu)點(diǎn)：

(1)轉(zhuǎn)錄和翻譯起始從正常的E.coli序列開(kāi)始，故通常可以產(chǎn)生高水平的融合蛋白。

(2)融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加穩(wěn)定。

(3)產(chǎn)生的融合蛋白較大，因此很容易從蛋白質(zhì)凝膠電泳中區(qū)別出來(lái)。融合蛋白帶可以從凝膠上切下，經(jīng)冷凍干燥，磨成粉末后即可作為抗原。

(4)有些融合蛋白帶有信號(hào)肽，可以分泌到細(xì)胞外，這有助于蛋白質(zhì)的分離和純化。三、表達(dá)融合蛋白的表達(dá)載體2122

融合型表達(dá)載體PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因23技術(shù)關(guān)鍵：克隆基因可插入標(biāo)簽肽序列的3’或5’端，但必須維持正確的ORF。選擇合適酶切位點(diǎn)加人工合成的DNA接頭構(gòu)建位相載體24位相載體----含有3種讀碼框的系列載體25常用的融合表達(dá)載體1、GST(glutahioneS-transferase,谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶)表達(dá)載體：如Amersham公司(阿莫仙醫(yī)藥公司)的pGEX系列，其GST來(lái)自于血吸蟲(chóng)，融合蛋白下保持酶學(xué)活性，對(duì)谷胱苷肽有很強(qiáng)的結(jié)合能力，融合蛋白純化出來(lái)后用凝血蛋白酶切割可得到純的目的蛋白。谷胱甘肽固定在瓊脂糖樹(shù)脂上形成親和層析柱表達(dá)融合蛋白的全細(xì)胞提取物通過(guò)層析柱融合蛋白吸附在樹(shù)脂上其他細(xì)胞蛋白被洗脫出來(lái)用含游離的還原型谷胱甘肽的緩沖液洗脫融合蛋白被釋放出來(lái)用凝血蛋白酶切割融合蛋白獲得純化的目的蛋白26位相載體Ptac：IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物，切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子融合型載體----pGEX系列2、組氨酸標(biāo)簽表達(dá)載體：如Novagen公司的pET系列，可在目標(biāo)蛋白的N-端或C-端加上6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽和Xa因子酶切位點(diǎn)，多聚組氨酸能與鎳等二價(jià)金屬離子結(jié)合，純化目的蛋白，用Xa因子處理可得到純的目的蛋白。

將2價(jià)重金屬陽(yáng)離子固定在樹(shù)脂上，便可對(duì)帶His標(biāo)簽的融合蛋白進(jìn)行親和層析分離。純化的融合蛋白再用Xa因子處理可去除標(biāo)簽多肽，從而獲得純化的目的蛋白。27283、內(nèi)含肽表達(dá)載體(即蛋白質(zhì)內(nèi)含子,是存在于前體蛋白質(zhì)中的一段氨基酸序列)：如NEB公司的Impact-Twin系統(tǒng)，將目的蛋白放在兩個(gè)可自裂解的內(nèi)含肽(intein)中間，在得到融合蛋白以后不通過(guò)蛋白酶消解、只需要調(diào)節(jié)pH值等條件就將標(biāo)簽蛋白切除。4、分泌表達(dá)載體：產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙，可避免受細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的降解，或使其正確折疊，或去除N-端甲硫氨酸，以維護(hù)活性。信號(hào)肽(signalpeptide)有堿性磷酸酶信號(hào)肽、蛋白質(zhì)A信號(hào)肽（如Amersham公司的pEZZ18系統(tǒng)）。29分泌型融合表達(dá)載體----pEZZ18Plac：Lac啟動(dòng)子Pspa：金黃色葡萄球菌蛋白A啟動(dòng)子S：蛋白A的信號(hào)肽序列兩個(gè)合成的Z功能域（結(jié)合免疫球蛋白G，瓊脂糖層析柱）四、表達(dá)產(chǎn)物的純化1、包涵體蛋白的純化通過(guò)機(jī)械法、超聲波處理等方法破碎外源蛋白的細(xì)胞→離心→獲得包涵體→洗滌→去除包涵體結(jié)合的細(xì)胞蛋白→利用鹽酸胍、尿素和SDS等溶解包涵體→蛋白質(zhì)重新折疊302、可溶性蛋白的純化融合蛋白的表達(dá)標(biāo)簽可用于分離純化目的蛋白分泌表達(dá)載體也有助于分離純化可溶性的表達(dá)產(chǎn)物。可溶性的表達(dá)產(chǎn)物一般可展現(xiàn)應(yīng)有的蛋白質(zhì)活性。31不同微生物種類(lèi)所產(chǎn)生的活性物質(zhì)類(lèi)型有明顯差異，不同的研究目標(biāo)應(yīng)選擇不同的宿主菌株。如70%的抗生素來(lái)源于放線菌，如以尋找抗菌抗腫瘤活性物質(zhì)為目標(biāo)，選擇鏈霉菌為宿主較理想，而篩選新的酶則采用大腸桿菌為宜。3233穿梭載體(shuttlevector)：能夠在兩類(lèi)不同的宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體，主要是質(zhì)粒，它們至少有兩套復(fù)制單元和兩套選擇標(biāo)記，相當(dāng)于兩個(gè)載體的聯(lián)合。通常穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆、擴(kuò)增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表達(dá)分析。

第二節(jié)穿梭載體34一、大腸桿菌/革蘭氏陽(yáng)性菌穿梭載體：如向枯草芽孢桿菌的穿梭。二、大腸桿菌/酵母菌穿梭載體：主要用于遺傳學(xué)和真核表達(dá)研究，尤其是當(dāng)?shù)鞍仔枰M(jìn)行真核修飾時(shí)，如磷酸化、糖基化等。三、其它穿梭載體：如動(dòng)物病毒載體、植物轉(zhuǎn)化的Ti質(zhì)粒、昆蟲(chóng)桿狀病毒等，更為復(fù)雜一些。第三節(jié)整合載體當(dāng)外源基因整合到宿主細(xì)胞的染色體后，可以穩(wěn)定地遺傳，進(jìn)而達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)的目的。整合載體：將某個(gè)基因或某些基因插入到染色體中去的載體。根據(jù)整合方式的不同可分為定點(diǎn)整合和隨機(jī)整合。根據(jù)其作用可分為目的基因的插入或敲除以及隨機(jī)突變體庫(kù)的構(gòu)建。353.1基因插入/基因敲除同源重組整合載體是最常用的整合載體，該載體不僅含有大腸桿菌克隆載體的骨架，更主要的是含有一段便于同源重組的重組DNA片段。

363.2隨機(jī)插入突變載體

隨機(jī)突變體庫(kù)——指標(biāo)記基因在載體的攜帶下通過(guò)DNA重組事件隨機(jī)插入基因組中而形成的突變體的集合。37（1）、微生物插入突變載體轉(zhuǎn)座子是一類(lèi)在細(xì)菌的染色體、質(zhì)粒或噬菌體之間自行移動(dòng)的遺傳成分,是基因組中一段特異的具有轉(zhuǎn)位特性的獨(dú)立的DNA序列。以pEG922為例，其可用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌插入突變體庫(kù)的構(gòu)建。該載體上含有在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中復(fù)制和選擇的復(fù)制區(qū)（該復(fù)制區(qū)是溫度敏感型的，在42℃下不能復(fù)制）和氯霉素抗性基因。38插入突變體庫(kù)的構(gòu)建將裝載了一個(gè)四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)座子Tn5401插入到載體pEG922中→將該載體轉(zhuǎn)化到革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌→轉(zhuǎn)座子發(fā)生一定頻率的轉(zhuǎn)座→在42℃下篩選僅有四環(huán)素抗性的菌落→得到的菌落就是發(fā)生轉(zhuǎn)座的突變子（由于在高溫下載體不能復(fù)制，隨著細(xì)胞的分裂，載體就會(huì)丟失，只有發(fā)生轉(zhuǎn)座事件的菌體才能表現(xiàn)出四環(huán)素抗性的表型。）392、構(gòu)建植物突變體庫(kù)所用的載體

根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入或植物轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽是植物基因功能研究中常用的產(chǎn)生突變體的方法。

（1）T-DNA插入突變體

根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA