第五章質(zhì)譜法測(cè)定分子結(jié)構(gòu)(二)大分子

有機(jī)質(zhì)譜原理及應(yīng)用第五章：質(zhì)譜法測(cè)定分子結(jié)構(gòu)(II),大分子1方法：ESI和MALDI兩種電離方法。對(duì)象：帶有官能團(tuán)的可溶解高分子。1988年，Tanaka，最早報(bào)道聚乙烯醇(PEG)，~22,000。1992年，Danis，MALDI，聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸，~30,000。

M.Karas&F.HillenkampMALDI，聚苯乙烯~70ku，PEG~40ku。1996年，C.Fenselau，聚苯乙烯~1500ku?！?.1高聚物質(zhì)譜分析2一、質(zhì)譜方法分析高聚物的特點(diǎn)1、人工合成高聚物的復(fù)雜性合成高分子是混合物，分子量是一種分布。不同的引發(fā)和終止反應(yīng)所得的高分子有不同的端基。在隨機(jī)共聚物中，高分子鏈的組成呈現(xiàn)某種化學(xué)分布。在嵌段共聚物中存在著不同的嵌段長(zhǎng)度和順序。非線性高分子，如環(huán)狀、支鏈和樹(shù)枝狀高聚物。2、質(zhì)譜分析高聚物的特色樣品用量少、耗時(shí)短、速度快。儀器分辨率高．使單體分析和端基分析成為可能。直接測(cè)定絕對(duì)分子量，而不是相對(duì)分子量，精度高于光散射和膜滲透方法。測(cè)定分子量時(shí)，不需要標(biāo)準(zhǔn)品或Mark-Houwink常數(shù)。由分子量分布可獲得聚合反應(yīng)的鏈增長(zhǎng)常數(shù)。3二、MALDI-TOF方法測(cè)定高聚物影響因素1、基質(zhì)基質(zhì)的作用：從激光脈沖中吸收能量。要求：基質(zhì)對(duì)激光光源必須有很強(qiáng)的吸收。使被測(cè)分子分離成單分子狀態(tài)。要求：基質(zhì)和被測(cè)高分子具有很好的相容性，同時(shí)不能有強(qiáng)的分于間的相互作用。使用不同種類的激光(IR，UV)電離，需要用不同類型的基質(zhì)。紫外激光解離的基質(zhì)蒽三酚和銀鹽的混合是分析聚苯乙烯的首選，但是這個(gè)混合物不穩(wěn)定，見(jiàn)表格。紅外激光解離的基質(zhì)YAG激光(3.27m，相當(dāng)于3050cm-1)激發(fā)C-H的伸縮振動(dòng)。應(yīng)用于UV-MALDI的基質(zhì)也可用于IR-MALDI。4MatricesPolymersHydrophilic2,5-dihydroxybenzoicacidPolypropyleneglycol-Cyano-hydroxycinnamicacidPolyvinylacetateFerulicacidPolytetramethyleneglycolIndoleacrylicacidPolymethylmethacrylateDithranolPolystyrenealltrans-RetinoicacidPolybutadieneDiphenylbutadienePolydimethylsiloxaneHydrophobic紅外激光與紫外激光電離的比較：紅外激光有較強(qiáng)的穿透能力，一次紅外激光照射能夠解吸更多的樣品，因此在一個(gè)樣品點(diǎn)上獲得的質(zhì)譜圖較少，要經(jīng)常更換激光照射點(diǎn)。紅外激光的脈沖較長(zhǎng)。一般在10～20s，而通常的紫外激光的脈沖約在3～5s，這導(dǎo)致了IR-MALDI的分辨率較差。一般來(lái)講，紫外激光器更適于分析合成高分子，紅外激光器可用于一些鹵代高分予的分析?；|(zhì)的選取：極性相似原則！常見(jiàn)基質(zhì)的極性比較5基質(zhì)Mr/cm-1(at337nm)PA(kJ/mol)2,5-DHB1540.79105-841~866854±14854±16-CHCA1890.79105-841933±9766±8芥子酸(SA)2241.10105-887894±13蒽三酚226-874±8IAA187-900±16HABA242-943766±8UV-MALDI基質(zhì)的理化性質(zhì)62、鹽效應(yīng)高分子測(cè)定過(guò)程中的陽(yáng)離子化不是質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，而是金屬離子與高分子發(fā)生陽(yáng)離子化反應(yīng)，形成加合的高分子正離子。一般用Na+、K+等作為加合離子。有時(shí)不需要特別加入這些金屬，亦可以得到加合的正離子，這是由于容器上的Na+或K+所致。具有雜原子的合成高分子，在加鈉鹽、鉀鹽后產(chǎn)生加合金屬陽(yáng)離子的正離子。聚醚、聚酯、聚丙烯酸酯、聚酷胺等。沒(méi)有雜原子的非極性合成高分子，如聚苯乙烯、聚丁二烯、聚異戊二烯在加入銀鹽或銅鹽后能夠成功的離子化，這些金屬陽(yáng)離于與高分子中的雙鍵發(fā)生了作用。沒(méi)有雜原子和雙鍵的合成高分子．如聚乙烯和聚丙烯目前仍較難被MAIDI分析，因?yàn)樗鼈兊慕饘訇?yáng)離子結(jié)合能極低。73、樣品制備簡(jiǎn)單混合法：在使用一個(gè)特定的樣品制備方法時(shí)，必須先選擇適用于基質(zhì)、樣品和陽(yáng)離子化鹽的溶劑，最理想的情況是使用一種溶劑．這樣可以減少樣品在靶上結(jié)晶時(shí)分層的危險(xiǎn)。然而，鹽類幾乎不溶于用于非極性合成高分子的有機(jī)溶劑。一般來(lái)講，鹽可以先溶于一個(gè)中間溶劑．如丙醇中，然后再用用于基質(zhì)和樣品的溶劑稀釋。制備樣品時(shí)，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)娜軇?、合適的濃度及配比，才能獲得較好的結(jié)果。電噴霧法一個(gè)很有前途的樣品制備方法是電噴霧沉積法，比起傳統(tǒng)的干點(diǎn)甚或薄層法，電噴霧法的優(yōu)點(diǎn)在于它可以形成小而均勻的結(jié)晶體。電噴霧沉積法制得樣品的點(diǎn)點(diǎn)之間重復(fù)性好，并且信號(hào)強(qiáng)度較大，層式的電噴霧效果更好一些。壓片法對(duì)于不溶的高分子樣品，如聚氨酯和大的多環(huán)芳香化臺(tái)物，發(fā)展了一砷新的制樣方法—壓片法．即將樣品和基質(zhì)按一定比例混合后用球磨機(jī)研磨均勻，壓成薄片進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。8三、MALDI-TOF方法測(cè)定高聚物的應(yīng)用1、分子量的測(cè)定及分子量的分布計(jì)算公式：當(dāng)分子量的分散度小于1.2時(shí)．可獲得符合Poisson分布的質(zhì)譜圖，與GPC的結(jié)果一致。Mn：數(shù)均分子量Mw：重均分子量PD：分布常數(shù)ni：第i個(gè)寡聚物的相對(duì)豐度Mi：第i個(gè)寡聚物的質(zhì)量PS2800的MALDI-TOF質(zhì)譜圖PEG2000的MALDI-TOF質(zhì)譜圖9PEG3100的MALDI-TOF質(zhì)譜圖PS29ku的MALDI-TOF質(zhì)譜圖聚合物數(shù)均分子量Mn重均分子量Mw分子量分布PD測(cè)定方法PS4600046760473191.01MALDI-TOF42000435001.03GPCPS7000073914745181.01MALDI-TOF66000675001.03GPCPEG1260012426124921.01MALDI-TOF11843123201.04GPCPEG23020022115221051.01MALDI-TOF20240212281.06GPCMALDI-TOF-MS方法與GPC方法所測(cè)分予量的比較102、末端基分析含有聯(lián)吡啶的共軛高分子結(jié)構(gòu)聚合物的MALDI-TOF質(zhì)譜(a)IAA為基質(zhì),(b)IAA為基質(zhì)。并加入細(xì)AgTFA11高分子化合物3(n=5)，環(huán)狀寡聚物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(左)和理論同位素分布(右)(a):[(C28H32N2S)5+H]+(b):[(C28H32N2S)5+Ag]+

選取2142.1u的單同位素峰來(lái)計(jì)算端基的質(zhì)量。重復(fù)單元的質(zhì)量是428.2,代入2142.1/428.2＝5，即428.25＝2141。這個(gè)峰的質(zhì)荷比等于5個(gè)重復(fù)單元加1個(gè)質(zhì)子比時(shí)帶上的氫原子的質(zhì)量，因此可以椎測(cè)這個(gè)系列的高分子為環(huán)狀高分子．沒(méi)有端基。1235u+158u+H+237u6=1616u35u+140u+H+237u6=1598u17u+140u+H+237u6=1580un=6一種寡聚物的MALDI-TOF質(zhì)譜分析兩種單體：三嗪聚胺的MALDI-TOF的質(zhì)譜133、高分子混合物分析用MALDI分析不同種類的高分子混合物的文章很少．也許是因?yàn)殡x子化效率的顯著不同和其他一些歧視固素。例如二兩種窄分布的標(biāo)準(zhǔn)品PS10200和和PMMA9200分別溶解在THF中，以幾種體積比混合，接著以IAA為基質(zhì)加甲酸鈉或以蒽三酚為基質(zhì)加三氟乙酸銀。在第一套實(shí)驗(yàn)方案中，PS和PMMA的體積比從0:1增加到199:1，基質(zhì)是IAA/Na，也就是對(duì)PMMA是最佳條件，試驗(yàn)結(jié)果十分令入驚奇，甚至PMMA是以05％的不純物存在干PS中，質(zhì)譜圖仍然是PMMA的[M＋Na]+峰為主要峰。在第二套實(shí)驗(yàn)中，PS和PMMA的體積比從1:0到1:9，基質(zhì)是蒽三酚/Ag．也就是PS的最優(yōu)化條件。在所有混合物實(shí)驗(yàn)中，PMMA是主要離子，而PS僅以相對(duì)干PMMA為10%的峰出現(xiàn)，質(zhì)譜圖上主要是PMMA的峰。當(dāng)然，這種有利于PMMA的歧視效應(yīng)也許可以用來(lái)檢測(cè)PS中中痕量的PMMA．但是從這些結(jié)果中也可看出，用MALDI分析高分子混合物還要走很遠(yuǎn)的一段路。144、嵌段型高分子分析嵌段共聚物之中嵌段和組成分布對(duì)于聚合物的最終性能有重要的影響。MALDI-TOF-MS也可以成功地應(yīng)用于嵌段型高分子的研究。Dams等人用MALDI分析了-甲基苯乙烯和乙烯基吡啶的嵌段共聚物。Wilezek-Vera等MALDI-TOFMS與1HNMR相結(jié)合，對(duì)苯乙烯/-甲基苯乙烯嵌段共聚物進(jìn)行研究，測(cè)定了該共果物的組成分布和嵌段長(zhǎng)度，我們研究組研究了榮乙二醇和聚苯乙烯的嵌段共聚物。用MALDI/TOF測(cè)得的分子量和以GPC測(cè)定的結(jié)果參見(jiàn)表。從表中可以青出，對(duì)干這類窄分布的高分子化合物，MALDI/TOF所得結(jié)果與GPC法所得結(jié)果比較接近。但是MALDI/TOF法更加迅速、方便，具有顯著的優(yōu)越性。MnMwPD共聚物GPC357737561.05No.1MALDI/TOF320735601.11共聚物GPC571963481.11No.1MALDI/TOF614265281.06GPC法和MALD/TOFMS法測(cè)得的分子量比較15§5.2藥物的質(zhì)譜分析一、生物活性物質(zhì)分析1、天然產(chǎn)物分析各種提取物的分析，HPLC/MS聯(lián)用分析RootsLeaves,Bark+Solvent

Filter

ConcentrateLC-MSnWherearetherebiologicallyactivecompounds?16Methanolic

根部提取物024681012141618202224262830Time(min)0102030405060708090100RelativeAbundance11.9411.088.703.172.0718.0213.4618.5414.0718.8316.9219.0015.1319.421.60水-甲醇梯度0.25mL/min,C-18Column20uL進(jìn)樣LC-UV(215nm)17LC-MS,基峰離子流圖2468101214161820Time(min)05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance9.494.814.5817.8811.896.7219.0819.553.1617.0114.3913.692.1415.408.1010.8720.026.257.975.093.5421.421.07Unknow水-甲醇梯度0.25mL/min,C-18Column20uL進(jìn)樣18300350400450500550600m/z58010203040501000102030405060708090RelativeAbundance473.1493.7460.8386.5300.2487.1400.3RT:9.21-9.61AV:8NL:1.28E6RT:11.78-11.94AV:4NL:7.42E5?(M-H)(M-H)負(fù)離子ESI全掃描質(zhì)譜圖(FullScanMS)Δ+14uUnknown119120140160180200220240260280300320m/z1000102030405060708090480510152025303540RelativeAbundance293.1179.1149.2311.9219.1180.5169.0294.2327.9121.1195.3144.9211.7275.2225.8164.0255.9244.5281.5324.9293.3307.2193.3325.8219.2179.3294.3308.3131.5200.5159.9276.1265.4233.3334.5246.5155.0285.1m/z293310.9OOOHOHOOHOHOHOHNegativeIonESIDataDependantMS/MSSpectraUnknown1Δ+14um/z17920300350400450500550600m/z58010203040501000102030405060708090RelativeAbundance473.1493.7460.8386.5300.2487.1400.3RT:9.21-9.61AV:8NL:1.28E6RT:11.78-11.94AV:4NL:7.42E5(M-H)(M-H)ProposedEchinacosideStructureatm/z487增加一個(gè)亞甲基21RT:0.11-21.822468101214161820Time(min)05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance9.494.814.5817.8811.896.7211.3919.0819.553.1617.0114.3913.692.1415.408.1010.876.257.975.093.5421.421.07ProposedEchinacosidesConfirmedEchinacosideOn-The-FlyAnalysis!22大腦促眠素的發(fā)現(xiàn)與確證從貓腦袋中取出腦髓液，用液相色譜分離各組分，用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜、氣質(zhì)聯(lián)用、薄層層析、紅外及核磁確定各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，目的是找出與睡眠規(guī)律有關(guān)的物質(zhì)。在貓睡眠周期的不同時(shí)間點(diǎn)采取腦髓液樣品，測(cè)定各樣品的紫外吸收光譜，發(fā)現(xiàn)貓?jiān)谔幱诩磳⑷胨癄顟B(tài)時(shí)，腦髓液試樣有一個(gè)特別顯著的紫外吸收峰。電噴霧四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析各樣品的色譜峰中有顯著差異的組分，發(fā)現(xiàn)m/z282的離子。并證明是MH+離子，用快原子轟擊磁質(zhì)譜測(cè)得其分子式為C18H35NO。CID實(shí)驗(yàn)：m/z282的MS2和MS3。在低質(zhì)量范圍，m/z282的子離子譜顯示長(zhǎng)鏈烷烴的特征。質(zhì)量數(shù)為17和35的中性丟失是母離子m/z282電離產(chǎn)生子離子m/z265，m/z247時(shí)產(chǎn)生的。在以上質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)上，綜合其它分析手段的表征結(jié)果，初步推測(cè)出這種催眠素的結(jié)構(gòu)為順-9,10-十八碳烯酰胺。該化合物的合成和結(jié)構(gòu)表征證實(shí)這一結(jié)構(gòu)推測(cè)是正確的。23大腦促眠素的MS/MS質(zhì)譜確定大腦促眠素的化學(xué)結(jié)構(gòu)腦髓液中分離出的促眠素化學(xué)結(jié)構(gòu)24結(jié)構(gòu)分析：確定代謝途徑，微量條件下進(jìn)行。定量分析：確定生物利用度等，在復(fù)雜本底的條件下測(cè)定。

OCH3NHClOSNHNHOOOH+OH?parent例：一種非胰島素依賴型糖尿病藥物的代謝分析(Noninsulindependentdiabetesdrug)

代謝物是有效的還是有害的?二、藥物代謝分析LC/MS/MS技術(shù)2524681012141618202224Time(min)050100RelativeAbundance23.878.7210.6511.8913.0116.79Glyburide代謝物10xOn-lineLC-MSn26100150200250300350400450500550m/z0102030405060708090100RelativeAbundance510512222199279241123391532176399369FullscanMSSpectrumofpeakat8.72minOn-lineData-DependantLC-MSnTriggerMass27150200250300350400450500m/z0102030405060708090100RelativeAbundance369371395352492m/z510>MS2On-lineData-DependantLC-MS228100120140160180200220240260280300320340360m/z0102030405060708090100RelativeAbundance169171304306288m/z510>m/z369>MS3On-lineData-DependantLC-MS329m/z369OCH3NHClOSNH2OOH+m/z395OCH3NHClOSNHOOO+m/z352OCH3NHClOSOO+m/z304OCH3NHClONH2+m/z288OCH3NHClO+m/z169OOCH3Cl+m/z510OCH3NHClOSNHNHOOOH+OHm/z492+OCH3NHClOSNHNHOOOHMS1MS2MS3FragmentationScheme30三、遠(yuǎn)電荷碎裂反應(yīng)(Charge-RemoteFragmentation)

遠(yuǎn)電荷碎裂：斷裂發(fā)生在遠(yuǎn)離電荷的位置，與質(zhì)譜解析一章中裂解均與電荷或自由基有關(guān)不同。主要原因是這種遠(yuǎn)電荷碎裂反應(yīng)發(fā)生在具有較長(zhǎng)的碳鏈化合物中，如長(zhǎng)鏈脂肪酸、膽汁酸、類固醇等。遠(yuǎn)電荷碎裂反應(yīng)在蛋白質(zhì)分析中有時(shí)也會(huì)發(fā)生。研究方法：高能、中能、低能碰撞誘導(dǎo)解離MS/MS質(zhì)譜。

高能碰撞：2~10kV，磁質(zhì)譜儀上，TOF/TOF等。低能碰撞:100V以內(nèi)，四極桿質(zhì)譜儀，離子阱質(zhì)譜儀。中能碰撞：100~1000V，扇形電場(chǎng)磁場(chǎng)/TOF聯(lián)用質(zhì)譜(特制質(zhì)譜)。311、遠(yuǎn)電荷碎裂的主要反應(yīng)機(jī)理長(zhǎng)鏈飽和化合物1,4氫消除反應(yīng)(1)兩步均裂反應(yīng)(2)產(chǎn)生荷基異位離子末端不飽和離子

長(zhǎng)鏈不飽和化合物(a)近烯丙基鍵，記作"Ap斷裂，Proximalallylbond。遠(yuǎn)烯丙基-乙烯基鍵distalallyl–vinylbond,"Avd近烯丙基-乙烯基鍵，記作Avp斷裂，proximalallyl–vinylbond。X=O+

或

OLi2+。3213-羰基-十八烷酸，12-羰基-十八烷酸的遠(yuǎn)電荷碎裂譜圖33十八烷酸CID-MIKES譜圖，[M-Ht2Li]+

(A)4,7-二烯十八烷酸,m/z293(B)6,9-二烯十八烷酸m/z293高能碰撞,6kV給出較多的信息，常用的遠(yuǎn)電荷碎裂的方法。34長(zhǎng)鏈脂肪酸[M-H]+離子的ES-MS/MS譜圖(a)硬脂酸，m/z283;(b)油酸,m/z281;(c)亞油酸,m/z279.譜圖采自于AutoSpec-OATOF儀器。碰撞能量400eV，Xe用作碰撞氣體。中能碰撞，400eV特殊設(shè)計(jì)的儀器上實(shí)現(xiàn)，有較多的信息。35低能CID譜，[M-Ht2Li]+，(4,7,10,13,16,19)-六烯二十二烷酸(docosahexaenoicacid,m/z341)。低能碰撞，400eV信息較少，特殊情況使用。36§5.3糖類的質(zhì)譜分析糖：生命體的能源供給者，傳統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。糖的生物活性：與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、磷酸脂結(jié)合成“糖復(fù)合物”(glycoconjugate)，血漿、酶、激素及細(xì)胞外膜均有含糖蛋白。糖復(fù)合物參與細(xì)胞的識(shí)別、增生、分異；維持生物體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和新陳代謝平衡。寡糖和多糖具有增強(qiáng)免疫力，抗輻射、抗腫瘤活性，成為藥物，中藥應(yīng)用，生物多糖，保健藥物，保健品。糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性：?jiǎn)翁堑慕M成為CnH2nOn(n=3~9)，其中n=5和6最為常見(jiàn)。每個(gè)單糖有多個(gè)手性碳原子。有鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)和環(huán)式結(jié)構(gòu)。寡糖和多糖的糖鏈?zhǔn)怯珊嘣u基的環(huán)狀己糖或戊糖通過(guò)苷鍵連接而成。各羥基環(huán)上有順?lè)串悩?gòu)體，各單糖分子上有五個(gè)手性碳，連接的位置和構(gòu)型多種多樣。37糖類分析的困難性：強(qiáng)極性，分離難，HPLC峰形不好。連接方式復(fù)雜，立體化學(xué)復(fù)雜。同系物多，糖苷鍵弱，復(fù)雜混合體系。電離效率不高、種類有限。16種單糖的常見(jiàn)結(jié)構(gòu)一、單糖及多糖的結(jié)構(gòu)1,核糖-D-呋喃核糖Rib2,阿戊糖-L-吡喃阿戊糖Ara3,戊醛糖-D-呋喃戊醛糖Xyl4,葡萄糖-D-吡喃葡萄糖Glc5,甘露糖-D-吡喃甘露糖Man6,半乳糖-D-吡喃半乳糖Gal7,海藻糖L-吡喃海藻糖Fuc8,乙酰氨基葡萄糖N-乙酰基-(-D-吡喃葡萄糖酰胺)GlcNAc389,葡萄糖醛酸GlcA10,鼠李糖L-吡喃鼠李糖Rha11,乙酰神經(jīng)氨糖酸NeuNAc12,胞壁酸2-氨基-3-氧-(1-羧乙基)-2-脫氧--D-葡萄糖Mur14,雞納糖6-脫氧--D-葡萄糖15,泰威糖Tyv16,D-果糖Fru一個(gè)典型的雙觸角氮連接多糖的結(jié)構(gòu)特征

觸角

核心區(qū)39二、質(zhì)譜分析電離方式：FAB：傳統(tǒng)的電離方法，主要集中于低聚寡糖的分析。ESI：對(duì)于常規(guī)的ESI，天然多糖的電離不如肽和蛋白，納升噴霧可以改善電離效率，可以達(dá)到與肽和蛋白相當(dāng)?shù)某潭取９烟堑挠H水性限制了ESI霧滴的表面活性，靈敏度低。納噴霧霧滴小，可以突破親水性的限制，靈敏度顯著升高。多糖的衍生化，減小親水性，可提高靈敏度，導(dǎo)致靈敏度提高的是表面活性的增加，而不是樣品的揮發(fā)性。MALDI：低聚物糖的電離效率基本與分子量無(wú)關(guān)。由于糖的不穩(wěn)定性，MALDI電離時(shí)會(huì)產(chǎn)生某些分解，尤其會(huì)產(chǎn)生亞穩(wěn)離子分解，可以用源后解離(PSD)技術(shù)測(cè)定亞穩(wěn)離子，但會(huì)使譜圖變得復(fù)雜。多糖碎片代號(hào)表示法非還原端用A,B,C表示。還原端用X,Y,Z表示。左上角標(biāo)表示，環(huán)中兩根斷裂鍵所連碳原子的編號(hào)(從環(huán)上氧原子開(kāi)始計(jì)數(shù)，紅色數(shù)字)，右下角的數(shù)字表示殘基的序號(hào)。40414243HumanGenomeProject§5.4核苷酸(Oligonucleotide)的質(zhì)譜分析UnderstandingTheGenomeToFightTheDiseaseY2KDrugDesign44500600700800900100011001200m/z05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance919.1915.41098.61102.9787.81107.3922.5784.5686.1790.6817.11147.9689.1851.6691.7956.7609.91070.71064.7905.3768.7617.31153.71061.7720.3959.3664.8901.71174.31040.0590.0549.1522.1NegativeIonESIOf18mer(200fg/uL)進(jìn)樣速度：3uL/min

乙腈-甲醇-丙酮(70:20:10,v/v/v,5%TEA)

毛細(xì)管溫度:100°COLIGO22#209-213RT:1.96-1.99AV:5NL:1.49E5T:-pFullms[450.00-1200.00]45OLIGO22#217-225RT:2.03-2.09AV:8NL:1.63E5T:-pFullms[450.00-1200.00]650700750800850900950100010501100m/z0102030405060708090100RelativeAbundance1102.91098.6918.8915.4787.5784.5689.3686.4611.2-5-6-7-8NegativeIonChargeStatesof18mer46#1RT:0.00P:-NL:3.85E5T:-pFullms[450.00-1200.00]48005000520054005600580060006200mass0102030405060708090100RelativeAbundance5520.05498.05541.05565.05745.04788.05972.05579.05385.05017.05221.04908.05116.06086.05762.06206.04821.0GATTCGTAGCTACGAATCReportedAvg.Mol.Wt:5500MonoisotopicMass:5497.7NegativeIonDeconvolutedSpectra47NegativeIonMS2Spectraofthe-5and-7ChargeStatesOLIGO22#435-444RT:4.86-4.98AV:10NL:1.29E5T:-cFullms21098.00@35.00[305.00-2000.00]400600800100012001400160018002000m/z020406080100RelativeAbundance926.81071.51134.41068.51236.0817.91290.81167.9782.6610.11009.91347.11636.1850.3617.71388.0770.21480.01637.0481.21854.3506.1426.11997.7OLIGO22#495-507RT:5.62-5.79AV:13NL:2.65E5T:-cFullms2784.00@35.00[215.00-2000.00]400600800100012001400160018002000m/z020406080100RelativeAbundance765.3886.7875.8617.8923.21134.3610.3860.1673.61014.81135.1461.51347.1549.31636.11235.1426.21413.11485.3306.31782.01880.2GATTCGTAGCTACGAATCGATTCGTAGCTACGAATC48§5.5蛋白質(zhì)分析一、氨基酸和小肽小肽斷裂碎片離子定義49研究小肽的結(jié)構(gòu)：MS/MS分析例：一個(gè)五肽的分析具有保護(hù)基的五肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)：

BOC－Gly－Ala－D－Val－Leu－Ile－OBzBOC=t-Butyloxycarbony,Bzl=benzyl.離子類型MH+[MH-56]+[MH-100]+y4"y3"y2"y1"b4b3b2b1m/z662606562505434335222441328229158yn"=yn50各離子的生成途徑[MH-56]+McLafferty重排[MH-100]+51bn系列離子

yn"系列離子,yn"=yn+252

bn和yn"系列離子生成的另一種機(jī)理53氨基酸名稱單同位素相對(duì)分子量羥胺正離子質(zhì)量氨基酸名稱單同位素相對(duì)分子量羥胺正離子質(zhì)量甘氨酸(glycine,Gly/G)57.0214630天冬氨酸(asparticacid,Asp/D)115.0269487丙氨酸(alanine,Ala/A)71.0371144谷氨酰胺(glutamine,Gln/Q)128.05858101絲氨酸(serine,Ser/S)87.0320360賴氨酸(lysine,Lys/K)128.09496101脯氨酸(proline,Pro/P)97.0527670谷氨酸(glutamicacid,Glu/E)129.04259102纈氨酸(valine,Val/V)99.0684172甲硫氨酸(methionine,Met/M)131.04049104蘇氨酸(threonine,Thr/T)101.0476874組氨酸(histidine,His/H)137.05891110半胱氨酸(cysteine,Cys/C)103.0091976苯丙氨酸(phenylalanine,Phe/F)147.06841120異亮氨酸(isoleucine,Ile/I)113.0840686精氨酸(arginine,Arg/R)156.10111129亮氨酸(leucine,Leu/L)113.0840686酪氨酸(tyrosine,Tyr/Y)163.06333136天冬酰氨(asparagine,Asn/N)114.0429388色氨酸(tryptophan,Trp/W)186.0793115920種氨基酸殘基（NH-HCR-C=O）和羥胺正離子的質(zhì)量54500600700800900100011001200130014001500160017001800m/z0100%998.2942.7893.2848.6808.3616.2771.5738.0617.21060.5999.61131.11061.81211.81132.51137.51305.01413.71541.91696.3160001700018000m/z0100%16951.4去卷積deconvolution20fmole馬心肌紅蛋白(HorseHeartMyoglobin)ESI質(zhì)譜圖二、蛋白質(zhì)分析55原始數(shù)據(jù)去卷積混合物：主要兩種betalactuglobulin56人血紅蛋白MALDI-TOF質(zhì)譜圖57雞蛋溶菌酶ESI質(zhì)譜圖58m/z1=895m/z2=945肌紅蛋白ESI質(zhì)譜圖59§5.6蛋白質(zhì)組學(xué)及應(yīng)用什么是蛋白質(zhì)組？由基因組，細(xì)胞或組織所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)成分。

蛋白質(zhì)組的重要性

研究基因組功能的重要途徑。

藥物目標(biāo)-在分子水平研究健康和疾病的相關(guān)。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門(mén)在整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)規(guī)律的新興學(xué)科。蛋白質(zhì)組學(xué)的終極目標(biāo)是測(cè)定生物物種的所有生命活動(dòng)中的所有蛋白質(zhì)。Why蛋白質(zhì)組學(xué)?mRNA表達(dá)水平不能預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平

蛋白質(zhì)的修飾和加工不能從基因序列直接推導(dǎo)

蛋白質(zhì)組是動(dòng)態(tài)的并反映生物系統(tǒng)的狀態(tài)60蛋白質(zhì)組學(xué)面臨的挑戰(zhàn)?蛋白質(zhì)沒(méi)有可進(jìn)行量的放大方法(如DNR的PCR方法)。?在生物處理過(guò)程中蛋白質(zhì)是高度動(dòng)態(tài)變化的。?物理化學(xué)性質(zhì)的多樣性。?動(dòng)態(tài)范圍的挑戰(zhàn)：相對(duì)含量超過(guò)106范圍(血清中可達(dá)1012)質(zhì)譜測(cè)量在蛋白質(zhì)組學(xué)中的作用?質(zhì)譜是肽(不是蛋白質(zhì))的一級(jí)序列分析的最普遍和最有效的工具。?質(zhì)譜是一種精確的定量工具，尤其是內(nèi)標(biāo)法定量(如對(duì)同位素比的測(cè)量)。?質(zhì)譜在確定蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)不是很有效。?質(zhì)譜對(duì)已知肽和蛋白質(zhì)重復(fù)定量分析不是很有效。61經(jīng)典的氨基酸序列分析方法N–端氨基酸單元的分析最常用的有下列兩種方法：桑格爾(SangerF)方法：利用肽鏈N–端游離氨基與2,4–二硝基氟苯(DNP)發(fā)生芳香親核取代反應(yīng)，而將肽鏈上的氨基酸逐個(gè)分解。埃德曼(Edman)方法：用異硫氰酸苯酯(PITC)和N–端的游離氨基反應(yīng)，將肽鏈上的氨基酸逐個(gè)分解。

C–端氨基酸單元的分析：通過(guò)羧肽酶催化水解用特定的酶催化使含某種氨基酸的肽鍵部位水解經(jīng)典分析方法的缺點(diǎn)工作量大、測(cè)序速度慢、樣品用量大。62蛋白質(zhì)的二維分離63

儀器 鑒定率肽質(zhì)量指紋譜 MALDI ~50%

(PeptideMassFingerprinter,

PMF)多肽序列標(biāo)簽 LC/MS/MS ~80%

(PeptideSequenceTag,

PST)從新測(cè)序

LC/MS/MS >

80%

(DeNovo)蛋白質(zhì)及混合物的定量分析：同位素編碼親和標(biāo)記(Isotope-CodedAffinityTags,ICAT)蛋白質(zhì)序列研究的三個(gè)層次64蛋白質(zhì)組研究技術(shù)路線樣品(組織、細(xì)胞等)凝膠圖象分析蛋白質(zhì)鑒定二維數(shù)據(jù)庫(kù)酶解HPLC-MS、MS/MS數(shù)據(jù)庫(kù)檢索二維凝膠電泳酶解肽混合物MS、MS/MS肽指紋譜肽序列標(biāo)簽從新測(cè)序65

一、肽質(zhì)量指紋譜(PeptideMassFingerprinter,

PMF)PMF測(cè)定速度快。PMF靈敏。

PMF需要完整和準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。66分離的酶解的蛋白質(zhì)96/384位樣品靶數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索質(zhì)譜樣品的準(zhǔn)備MALDI質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果PMF方法的一般流程67

洗膠/去污

脫水

減少S-S鍵

洗滌/脫水1、In-gel酶切/消化Multiprobe(4x96WellPlat)

樣品體積0.5-100L

板上加熱和冷卻

消化板加熱37oC

肽存儲(chǔ)在-4oC冷卻板

酶試劑存儲(chǔ)在-4oC冷卻板

修正-SH基

加入trypsin溶液5-12小時(shí)

肽提取2、質(zhì)譜分析樣品的制備

靈敏度：500fmolesBSAin-gel。

移液和消化時(shí)間8小時(shí)(1x96wellplat)。

最多可進(jìn)行4x96wellplat的同時(shí)消化?；灸芰?83、質(zhì)譜測(cè)定設(shè)這檢索的條件，不同軟件有不同的參數(shù)和用法。MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定4、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索parmeters參數(shù)的選擇樣品-1樣品-2樣品-3ProgramusedMS-FitPeptIdentPeptIdentpIrangeNO3~73.7~7.7Proteinmassrange20~50kD15~45kD15~45kDSpeciesearchedMAMMALSMAMMALSMAMMALSDigestusedTrypsinTrypsinTrypsinPeptidemassaccuracy±2Da±0.5Da±0.5DaMethioniceisOxidizedOxidizedOxidizedCysteineisCarbamidomethylation(Cys-CAM)PepptidemassesareAverageMonoisotopicMonoisotopicMumberofpeptides555Numberofmissedcleavages111Numberofpeptideusedinsearch11171569樣品1樣品2樣品3數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果：帶*號(hào)的峰為與數(shù)據(jù)庫(kù)中的峰相匹配的峰。樣品1：甘油醛-3-磷酸脫氫酶樣品2：遍在蛋白羧酸基末端水解同工酶樣品3：丙糖磷酸異構(gòu)酶70PMF實(shí)驗(yàn)，同一點(diǎn)上經(jīng)常是蛋白質(zhì)的混合物SomeproteinsareidentifiedwithhighconfidenceSomeproteinsareidentifiedwithhighconfidenceSomeproteinsareidentifiedwithlowconfidenceRowdata71AndtherearestillpeptidesunassignedtoaproteinFinalresult72特有的搜索引擎73二、多肽序列標(biāo)簽(PeptideSequenceTag,

PST)和肽階梯序列(PeptideLadderSequencing)1、肽序列標(biāo)簽蛋白質(zhì)的常見(jiàn)氨基酸有20種，一般3個(gè)氨基酸的肽段碎片將有8000種可能的排列方式4個(gè)氨基酸將有160000種排列方式，因此即使對(duì)于不是很大的原核生物的蛋白質(zhì)組來(lái)說(shuō)，一個(gè)短的序列片段也具有很高的特異性。肽序列標(biāo)簽：一個(gè)多肽的部分氨基酸序列和該肽的質(zhì)量以及該肽未測(cè)序部分的質(zhì)量。MannM.etal,Anal.Chem.,1994,66,4390forPSTMannM.etal,TrandsinBiochem.Sci.,1996,21,494.74

例：馬心肌紅蛋白鑒定

馬心肌紅蛋白胰酶酶切產(chǎn)物的ESI-Q-TOF肽指紋譜75馬心肌紅蛋白胰酶酶切肽段m/z908.4(雙電荷離子)的MS/MS譜圖肽序列標(biāo)簽：G—L—S—D—G—E—W—Q—Q—V—L—N—V—W—G—Ky10,1257.8y3,390.3C端N端W—Q—Q—V—L—N—V—WY3,390.3y10,1257.8檢索結(jié)果：76N端Y—A—M—I—G—D—P—T—G—A—L—RC端y10,1000.5y7,715.4

例：m/z為691.43Da(M2+)，質(zhì)量數(shù)為1380.6Da。

MS/MS圖肽序列標(biāo)簽：檢索結(jié)果：來(lái)自乙醇脫氫酶715.4(DGI)1000.5772、肽階梯序列(PeptideLadderSequencing)梯狀測(cè)序法(laddersequencing)：用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，相互間差一個(gè)氨基酸殘基的系列肽，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基，與Edman法相似。AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnPTC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AanPC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnPITC+5%PICATZ(AA1)+AA2-AA3-AA4-AA5--AAn

PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnAcid(TFA)

aftermcyclesFurthercycles(withoutseparation)PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnPC-AA2-AA3-AA4-AA5--AAn

PC-AA3-AA4-AA5--AAnPC-AA4-AA5--AAn

PC-AAm--AAn一步MALDI-MS階梯序列數(shù)據(jù)B.Chaitetal.,Science

262,89,1993.原理：78血纖維蛋白肽:ProteinladderSequencing[Glu1]fibrinopeptideB79傳統(tǒng)的低能量CADMS/MS質(zhì)譜圖80MALDIPSD與高能CID的比較81可選擇性的碎裂方式：光誘導(dǎo)解離(UV-193nm)

相當(dāng)于高能CID。多光子電離(IR-10.6μm)

相當(dāng)于低能CAD。表面解離(SID)相當(dāng)于低能CAD。電子捕獲解離(ECD)c和z類型碎片增強(qiáng)。注：這些方法在自動(dòng)化大批量實(shí)驗(yàn)中并不是常規(guī)的方法。

數(shù)據(jù)庫(kù)搜索為什么會(huì)失敗蛋白質(zhì)不在數(shù)據(jù)庫(kù)里或者不正確的搜索參數(shù)(酶特征，分類法等等)。在數(shù)據(jù)庫(kù)里蛋白質(zhì)表達(dá)不正確(DNA核苷酸序列，基因內(nèi)區(qū)序列等等預(yù)測(cè)失敗)。蛋白質(zhì)變性.-變性的氨基酸殘基-N端和C端的變化：蛋氨酸的形成，序列信號(hào)變化，C鏈縮短-可變的序列(同族以及選擇性結(jié)合的變體)-后修飾變化(糖基化，磷酸化等)-不希望的化學(xué)誘導(dǎo)修飾(在尿素中氨甲?；?搜索引擎不夠完善成熟。82三、重新測(cè)序(Denovosequence)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有的蛋白質(zhì)分析樣品來(lái)源于非序列化基因組蛋白質(zhì)經(jīng)多重高度修飾在實(shí)際生物體中，非同尋常的酶活性處理古生物樣本，樣品處理時(shí)肽被修飾(污染)合成肽重新測(cè)序的原因

譜圖的預(yù)處理多電荷峰轉(zhuǎn)化成單電荷峰多同位素峰轉(zhuǎn)化成擔(dān)同位素峰簡(jiǎn)化譜圖提高信噪比83譜圖處理譜圖分析84

16O/18OC端標(biāo)記為了提高對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解讀能力，尤其是對(duì)y和b型離子系列的辨別能力，用化學(xué)修飾方法使辨別更容易。

16O/18OC端標(biāo)記：在蛋白質(zhì)酶解時(shí)，酶解液中H218O和H216O各占50%，酶解后肽段羧基端上的羥基氧18O/16O的(M+2/M)同位素豐度比高于正常的峰強(qiáng)度，據(jù)此可以分辨出y系列離子。給出C-端離子的唯一特征碎片離子85denovo序列解釋馬爾可夫鏈蒙特卡洛(MarkovchainMonteCarlo)denovo

序列產(chǎn)生算法貝葉斯規(guī)則(Bayesian)斷裂方式和譜圖匹配算法Beta牛乳糖m/z841.5的MS/MS