臨床生物化學(xué)檢驗常用技術(shù)課件

臨床生物化學(xué)檢驗常用技術(shù)

第三章1第一節(jié)光譜分析技術(shù)第二節(jié)電化學(xué)分析第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)第四節(jié)電泳技術(shù)第五節(jié)層析技術(shù)第六節(jié)離心技術(shù)第七節(jié)自動生化分析技術(shù)

本章內(nèi)容概要2教學(xué)目標(biāo)和要求1、掌握分光光度技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。掌握電化學(xué)分析方法基本原理2、熟悉分光光度計的基本結(jié)構(gòu)和操作方法光源檢查和波長校正、原子分光光度計的類型和影響熒光分析的因素。熟悉離子選擇電極分類，離子選擇電極的分析方法3、了解其他光譜分析技術(shù)的基本原理及在生化檢驗中的應(yīng)用。3一、光譜分析技術(shù)的基本原理：利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。1、光譜分析技術(shù)分類：發(fā)射光譜分析技術(shù)：火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法

吸收光譜分析技術(shù)：紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光度法和紅外光譜法

散射光譜分析技術(shù)：比濁法

5微粒性(E=hv)波粒二象性波動性(=c/v)E=hv=hc/----光的能量與光的波長成反比，與光的頻率成正比2、光的基本性質(zhì)---高速傳播的電磁波63、物質(zhì)對光吸收的基本原理：能量轉(zhuǎn)移----當(dāng)光輻射通過某種物質(zhì)時，組成該物質(zhì)的分子（原子）與光子發(fā)生“碰撞”，光子的能量因此轉(zhuǎn)移至分子（原子）上，使它們由基態(tài)(低能態(tài))躍遷到激發(fā)態(tài)(高能態(tài))，這種躍遷稱為激發(fā)。7能量釋放----處于較高能態(tài)的分子(激發(fā)態(tài)分子)不穩(wěn)定，當(dāng)其返回基態(tài)時，以熱或發(fā)射光譜的形式將能量釋放出來。所發(fā)射出的相應(yīng)光譜，稱分子發(fā)射光譜。9E1E0吸收光譜發(fā)射光譜激發(fā)態(tài)基態(tài)E1＞E010

（1）根據(jù)產(chǎn)生光譜的物質(zhì)結(jié)構(gòu)原子光譜(atomicspectrum)分子光譜(molecularspectrum)4.分類11②發(fā)射光譜(emissionspectrum)分析法：

根據(jù)物質(zhì)受到熱能或電能等的激發(fā)后所發(fā)射出的特征光譜來進行定性及定量分析的一種方法。原子發(fā)射光譜法(atomicemissionphotometry)分子發(fā)光分析法13

1、定義：

根據(jù)被測物質(zhì)對各種不同波長光的吸收能力，繪制吸收曲線，并根據(jù)曲線的特性鑒定物質(zhì)的方法。

屬光譜分析法。二分光光度法14可見光：400~700nm,有色物質(zhì)溶液紫外光：200~400nm,無色物質(zhì)153、應(yīng)用：（1）定性分析定性鑒定純度鑒定

結(jié)構(gòu)分析（2）定量分析17（一）光吸收的基本定律

1、定律：單色光通過吸光溶液后，吸光度與溶液的濃度和厚度之間呈正比關(guān)系。

18（1）Lambert定律：說明吸收與溶液液層厚度間的關(guān)系L1L2入射光透過光入射光透過光L2＞L1，I1＞I2I0I1I0I219

2、表達式：

-lgI/Io=-lgT=KLC

A=-lgT=KLC

I/Io為透光率(Transmittance,T)A為吸光度(Absorbance)K為吸光系數(shù)(absorptivity)L為液層厚度C為溶液濃度(concentration)摩爾吸光系數(shù)ε：當(dāng)溶液層厚度單位為cm，濃度單位為mol/L時，K即成為摩爾吸光系數(shù)21光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源

在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。（二）分光光度計的基本結(jié)構(gòu)222.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。23（三）分光光度計的類型1.單光束

簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束自動記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價格較高。253.雙波長將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快束交替通過同一吸收池而后到達檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比池。△=1～2nm。兩波長同時掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。26Beckman紫外-可見分光光度計eppendorf紫外-可見分光光度計29（四）分光光度計的操作方法A.分光光度計的基本操作以721-A型分光光度計為例，其基本的操作步驟為：1.開721-A分光光度計的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通電20分鐘使儀器預(yù)熱。2.將波長旋至測定的波長。3.將空白液、校準(zhǔn)液或待測液放入比色池，將空白液置于光路中。4.將開關(guān)置于T位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細調(diào)調(diào)節(jié)T為0.0,關(guān)上比色池蓋子，調(diào)節(jié)T為100.0。5.將開關(guān)置于A，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)A為0.06.重復(fù)步驟4和57.將校準(zhǔn)液或待測液推入光路，測量溶液的吸光度（A）30B.吸光度的校正

鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計的吸光度。在25℃，將4mg鉻酸鉀溶于100ml的0.05mol/LKOH中，放入比色池中，在不同波長下測定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進行比較，可檢測儀器吸光度的準(zhǔn)確度。31使用圖示 1.開啟電源，指示燈亮，儀器預(yù)熱10分鐘，選擇開關(guān)置于“T”。2.打開試樣室蓋（光門自動關(guān)閉），調(diào)節(jié)“0%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”。323.將裝有溶液的比色皿放置比色架中。4.旋動波長手輪，把測試所需的波長調(diào)節(jié)至刻度線處。335.蓋上樣品室蓋，將參比溶液比色皿置于光路，調(diào)節(jié)透過率“100%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0T”（如果顯示不到100%T，則可適當(dāng)增加靈敏度的檔數(shù)，同時應(yīng)重復(fù)“2”，調(diào)整儀器的“00.0”）。 346.將參比溶液比色皿置于光路中，將選擇開關(guān)置于A，旋動吸光度調(diào)零旋鈕，使得數(shù)字顯示為.000，然后移入被測溶液，顯示值即為試樣的吸光度A值。358．全部測定結(jié)束后，取出比色皿(洗凈)，關(guān)閉開關(guān).36三、分光光度技術(shù)的定性和定量方法（一）分光光度技術(shù)的定性方法定性依據(jù)：最大吸收波長λmax和摩爾吸光系數(shù)ε2.摩爾吸光系數(shù)ε方法1.最大吸收波長λmax方法37（二）分光光度技術(shù)的定量方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法

將一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照一定操作過程顯色后，分別測吸光度(A)，以A為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線(至少要5點)。在相同條件下處理待測物質(zhì)并測定其吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線找出相對應(yīng)的濃度方法：38AXCXA（吸光度）C（濃度）39制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)注意下面幾點：（1）測定條件發(fā)生變化時（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新繪制。（2）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。（3）當(dāng)待測液吸光度超過線性范圍時，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測定。（4）標(biāo)本測定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時的條件完全一致。402．比較法

CX=(AX×Cs)/As己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時測定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計算出標(biāo)本的濃度，計算公式為：其中Cx和Ax為標(biāo)本管濃度和吸光度，Cs和As分別為標(biāo)準(zhǔn)管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近。413．其它分析方法包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法。42四、其它光譜分析技術(shù)（一）火焰光度法（二）原子吸收分光光度法（三）熒光光度分析法1．基本原理2．組成1．基本原理2．組成3．原子吸收分光光度法的特點

3．熒光光度定量分析法4．熒光光度分析技術(shù)的應(yīng)用1．基本原理2．影響熒光強度的因素43火焰光度法——等離子體發(fā)射光譜法44原子吸收分光光度法45熒光光度法NanoDrop?ND-3300Fluorospectrometer

46第二節(jié)電化學(xué)分析電化學(xué)分析方法基本原理離子選擇電極分類離子選擇電極的分析方法47電化學(xué)分析是利用物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)，測定化學(xué)電池電位、電流或電量的變化進行分析的方法。電化學(xué)分析方法電位分析法：測定原電池電動勢以求物質(zhì)含量的分析方法電導(dǎo)法：通過電阻測定以求物質(zhì)含量的分析方法電容量分析法：借助某些物理量的突變作為分析重點的指示48電位分析法是利用電極電位和濃度之間的關(guān)系來確定物質(zhì)含量的分析方法。一、電化學(xué)分析方法基本原理原電池是利用兩個電極之間金屬性的不同,產(chǎn)生電勢差,從而使電子的流動,產(chǎn)生電流.又稱非蓄電池，是電化電池的一種。49電池電動勢和電極電勢電池電動勢：將電位差計接在電池的兩個電極之間而直接測得的電勢值習(xí)慣上稱之為電池的電動勢電極電勢：當(dāng)采用相對電勢法時，系用一定的參比電極與研究電極組成電池，這一電池的電動勢稱為相對于給定參比電極而確定的研究電極電勢。(金屬和溶液相接觸的內(nèi)電位差即為金屬電極和溶液間的電極電勢)所謂“電極/溶液”之間的絕對電勢不但無法直接測量，在處理電極過程動力學(xué)問題時也不需要用到它。在計算電池電動勢時，也完全可以采用相對電極電勢來代替絕對電極電勢。50Theabsolutepotentialdifferenceacrossasingleelectrifiedinterfacecannotbemeasured!Itisnotnecessarytoknowexactvalueofitbutthedifferenceofabsolutepotentialdifferenceisimportantforelectrochemists!單個界面上的絕對電位是不可測的，對于電化學(xué)研究重要的是其差值51參比電極顧名思義，參比電極是給出一個固定的值，其它的電極電勢的測量以此為基礎(chǔ)。一個好的參比電極應(yīng)該不受溫度、時間和通過小電流而變化,應(yīng)遵守Nernst方程。指示電極指示電極的電位隨離子濃度而變化，能指示待測離子濃度。52二離子選擇性電極1、定義：離子選擇性電極是一種以電位法測定某些特定離子活度的指示電極。2、特點：電極的關(guān)鍵部件敏感膜對溶液中特定離子有選擇性響應(yīng)。敏感膜并不給出或得到電子，而是選擇性地讓某些離子滲透，同時包含離子交換過程3、測定原理：基于內(nèi)部溶液與外部溶液之間產(chǎn)生的電位差，即膜內(nèi)外被測離子活度的不同而產(chǎn)生電位差，稱之為膜電位。53544、離子選擇性電極分類原電極（主體電極）晶體膜電極非晶體膜電極單晶膜電極多晶膜電極如：各種玻璃電極、液態(tài)膜電極如：氟電極如：氯電極（Agcl+Ag2S）敏化電極氣敏電極酶電極其它如NH3電極SO2電極等如尿素酶電極等細菌電極生物電極免疫電極等按國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）建議分類555、離子選擇性電極的基本構(gòu)造膜電極的構(gòu)成1、電極桿（玻璃或塑料管）2、內(nèi)參比電極（銀－氯化銀）3、內(nèi)參比溶液4、敏感膜（關(guān)鍵部件）56（一）非晶膜電極—玻璃電極

內(nèi)參比電極：Ag—AgCl電極。玻璃泡：敏感膜內(nèi)參比溶液：pH一定的緩沖溶液。1玻璃電極的結(jié)構(gòu)三常用的離子選擇性電極57（2）玻璃電極及膜電位：玻璃電極是最早使用的離子選擇性電極。玻璃薄膜是決定電極性能的最重要組成部份。內(nèi)參比電極的電位是恒定的，與被測溶液的PH無關(guān)。玻璃電極用作測PH的指示電極，是因為跨越玻璃膜產(chǎn)生了膜電位。膜電位與待測溶液PH值有關(guān)。58在任意溫度T下：

根據(jù)此公式，通過測定玻璃電極的電極電位，可求出膜外試液的H+活度。這是使用玻璃電極測量pH的理論根據(jù)和基本計算關(guān)系。

593.玻璃電極的優(yōu)點選擇性高：膜電位的產(chǎn)生不是電子的得失。其它離子不能進入敏感膜產(chǎn)生交換。當(dāng)溶液中Na+濃度比H+濃度高1015倍時，兩者才產(chǎn)生相同的電位；不受溶液中氧化劑、還原劑、顏色、沉淀及膠體、雜質(zhì)的影響，不易中毒；改變玻璃膜的組成，可制成對其它陽離子響應(yīng)的玻璃膜電極。60（二）氣敏電極

氣敏電極端部裝有透氣膜，氣體可通過它進人管內(nèi)。管內(nèi)插入pH玻璃復(fù)合電極，復(fù)合電極是將外多比電極（Ag／AgCI）繞在電極周圍。管中充有電解液，也稱中介液。試樣中的氣體通過透氣膜進入中介液，引起電解液中離子活度的變化，這種變化由復(fù)合電極進行檢測。如CO2氣敏電極，用PH玻璃電極作為指示電極，中介液為0.01mol/L的碳酸氫鈉。二氧化碳與水作用生成碳酸，從而影響碳酸氫鈉的電離平衡來指示CO2。61該類電極其實是一種復(fù)合電極：將pH玻璃電極和指示電極插入中介