THSPP 0005-2022 茄科植物攜帶柑橘裂皮類病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB16團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/HSPP0005—2022茄科植物攜帶柑橘裂皮類病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程CodeofPracticeforDetectionofCitrusexocortisviroidcarriedbySolanaceaeplants(發(fā)布稿)2022-10-10發(fā)布 2022-11-10實(shí)施湖北省植物保護(hù)學(xué)會(huì) 發(fā)布T/HSPP0005—2022T/HSPP0005—2022II目 次前 言 II1范圍1-21-31-4-1-51-儀器設(shè)備1-主要試劑1-61-7檢測(cè)方法1-樣品制備2-7.1.1種子類2-7.1.2種苗類2-RNA2-2-分子雜交2-結(jié)果判定3-8-3-留樣保存3-結(jié)果記錄3-建檔3-附 錄 A（參性）柑裂類毒本息-4-附 錄 B（參性錄核酸取法-5-附 錄 C（參性錄分子交法-6-附 錄 D（規(guī)性錄）橘皮病檢流程圖-8-T/HSPP0005—2022T/HSPP0005—2022IIII前 言GB/T《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第本文件主要起草人：王琴、張建坤、許劍濤、孫俊、徐文興、李倩、李喬、徐雪、華益、趙梅榮、劉振、鄭鑫浩、孫民琴、李彬、吳翠萍、王振華。T/HSPP0005—2022T/HSPP0005—2022-PAGE3-茄科植物攜帶柑橘裂皮類病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了柑橘裂皮類病毒的檢測(cè)技術(shù)規(guī)程。本文件適用于番茄、辣椒、馬鈴薯等茄科植物種子及種苗中柑橘裂皮類病毒的檢測(cè)和鑒定。（GB/T66822964本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。exocortisviroid類病毒名及縮寫(xiě)：citrusexocortisviroid，CEVdPospvodaPospvroA。感量0.001PHPCR（2.5μL20μL，1000μL）除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。商品化Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、脫氧核糖核苷酸、PCR緩沖液、引物和探針、Tris-乙酸電泳緩沖液，硝酸銀溶液等。核酸提取相關(guān)試劑符合附錄B的要求；分子雜交試劑應(yīng)符合附錄C的要求。DSN/T2964樣品制備每份送檢樣本中選取100~200粒種子，表面消毒后，置于鋪有吸水紙的白瓷盤(pán)或培養(yǎng)皿中，20℃~25℃、12h/12h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)直至萌發(fā)。隨機(jī)抽取葉片1g~5g，置于去RNA酶的研缽中，加入液氮后迅速研磨成細(xì)粉狀，制成檢測(cè)樣品。g~200RNARNA提取100TrizolRNACEVdCEVdB。核酸提取也可選擇相應(yīng)商業(yè)化試劑盒。RT-PCR檢測(cè)cDNA0.2mLPCR管中加入DEPC處理去離子水10μL、模板RNA3μL（50ng~200ng），隨機(jī)引物1μL，95℃（或沸水）水浴7min，迅速置冰上冷卻3min；然后加5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL、10mmol/LdNTPs、40U/μLRNAase抑制劑（Rnasin）0.5μL、200U/μL反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）0.5μL，混勻后37℃水浴1h；反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后瞬時(shí)離心，95℃（或沸水）水浴5min，冰浴3min，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。cDNA合成也可采用相應(yīng)商業(yè)化試劑盒。PCR反應(yīng)體系：0.2mLPCR管中加入10×PCRbuffer（含Mg2+）2.5μL，dNTPs（10mmol/L）2μL，引物（均為10μmol/L）各1.0μL（見(jiàn)表1），5U/μLTaq酶0.5μL，模板cDNA3μL，加DEPC處理水至總體積25μL。每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)平行反應(yīng)，以雙蒸水代替模板作為空白對(duì)照。表1PCR反應(yīng)特異性引物及序列引物名稱引物序列（5'-3'）產(chǎn)物大?。╞p）CEVd371FCCGGGGATCCCTGAAGGA371CEVd371RGGAAACCTGGAGGAAGTCG反應(yīng)程序：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。也可采用一步法RT-PCR商業(yè)化試劑盒，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件可根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。制備1.5%15PCR110Vmin）對(duì)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的CEVd序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析，驗(yàn)證樣品檢測(cè)結(jié)果。分子雜交RocheCEVdRNA-20℃33min68℃12μLRNA10h具體操作步驟參見(jiàn)附錄C。結(jié)果判定對(duì)照成立的前提下，檢測(cè)結(jié)果按照以下原則進(jìn)行判定：——樣品RT-PCR和分子雜交兩種檢測(cè)方法均為陽(yáng)性，可判定樣品中攜帶有柑橘裂皮類病毒；——樣品RT-PCR檢測(cè)或分子雜交檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，經(jīng)測(cè)序分析驗(yàn)證與已知的CEVd序列相似性達(dá)90%以上，可判斷樣品攜帶柑橘裂皮類病毒；——樣品RT-PCR和分子雜交兩種檢測(cè)方法均為陰性，可判定樣品未攜帶柑橘裂皮類病毒。留樣保存檢出柑橘裂皮類病毒的種子、生長(zhǎng)苗木樣品以及7.1剩余制樣于-80℃冰箱內(nèi)保存。樣品應(yīng)保存至少6個(gè)月。保存期滿后，應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后方可處理。結(jié)果記錄RT-PCR檢測(cè)結(jié)果電泳照片、分子雜交檢測(cè)結(jié)果照片、測(cè)序報(bào)告和序列分析結(jié)果圖應(yīng)一并保存。建檔--PAGE8-附 錄 A（資料性附錄）柑橘裂皮類病毒基本信息蕓香科（Rutaceae）、馬鈴薯（Solanumtuberosum）、番茄（Solanumlycopersicum）、（Solanum（Petunia（Daucus（Petunia（Gynura）、柑橘屬（Citrus）、香櫞（Citrusmedica）等。CEVd通過(guò)嫁接、花粉、種子和刀具機(jī)械傳播。遠(yuǎn)距離通過(guò)種苗調(diào)運(yùn)傳播。/接穗的柑橘上的癥CEVdCEVd基因組為單鏈環(huán)狀RNA分子，基因組大小約371nt，GC含量高，分子內(nèi)部堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的桿狀或擬桿狀二級(jí)結(jié)構(gòu)，在一定條件下可形成發(fā)夾狀變形結(jié)構(gòu)。CEVd基因組包含5個(gè)功能區(qū)：左末端區(qū)(TL)、致病區(qū)(P)、中央保守區(qū)(C)、可變區(qū)(V)和右末端區(qū)(TR)。附 錄 B（資料性附錄）核酸提取方法DEPC處理超純水：取制備好的去離子水500mL，加入500μLDEPC搖床震蕩過(guò)夜，高溫高壓滅菌后室溫保存；1mol/LTris-HCl（pH8.0）：稱取12.11gTris·base，加50mLDEPC處理超純水溶解，用濃HCl調(diào)pH值至8.0，定容至100mL，高溫高壓滅菌后室溫保存；0.5mol/LEDTA（pH8.0）：稱取18.61gNa2EDTA·2H2O，加80mL處理超純水溶解，用約2gNaOH調(diào)pH值至8.0，加DEPC100μL，定容至100mL，搖床震蕩過(guò)夜，高溫高壓滅菌后室溫保存；10×TE（pH8.0）：取1mol/LTris-HCl（pH8.0）10mL和0.5mol/L（pH8.0）2mL，加50mLDEPC處理超純水溶解，定容至100mL，高溫高壓滅菌后室溫保存。稱取7.1制備的檢測(cè)樣品100mg，轉(zhuǎn)入已滅菌的去RNA酶離心管；立即加入1mLTrizol，渦旋振蕩15s，室溫靜置15min；加400μL氯仿，上下顛倒混勻，室溫靜置2min，4℃12000r/m離心15min；取上清于新的離心管中，加無(wú)加入等體積的異丙醇沉淀，輕微顛倒，-20℃沉降1h；12000r/m離心15min；棄上清，沉淀中加1mL預(yù)冷的75%酒精，上下顛倒10次，12000r/m離心5min，棄上清；瞬間離心20s，吸去多余液體，室溫干燥5-10min，加30μLDEPC處理的去離子水溶解，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。也可選擇市售商品化提取試劑盒進(jìn)行核酸提取。附 錄 C（參考性附錄）分子雜交方法C.1試劑與材料C.1.1核酸雜交相關(guān)試劑175.3gg800mLHCl調(diào)pH值至7.0，最后用定容至1L，高溫高壓滅菌后室溫保存；50×Denhardt’s1gFicoll400，1gPVP-40，1gBSA80mL100-206×SSC5×Denhardt50%(w/v)Formamide0.5%(w/v)SDS100μg/mL鮭魚(yú)精DNA（用前加熱變性后加入）；雜交液：預(yù)雜交液中加入DIG-RNA探針，稀釋成適當(dāng)濃度；0.73gNaCl，0.24gNa2HPO4，0.1gNaH2PO4，5gSDS80mL水中，100洗滌液I：為1/10稀釋的封閉液；洗滌液II：將0.24gTris·base，1.16gNaCl，0.4gMgCl2溶于160mL水中，用HCl調(diào)pH至9.5，定容至200mL，過(guò)濾除菌后室溫保存；MOPS200mmol/LMOPSpH7.050mmol/LNaAc10mmol/LMaleicacid100mmolMaleicacid、150mmolNaCl，pH7.5；洗膜緩沖液：100mmolMaleicacid、150mmolNaCl、0.3%(v/v)Tween20，pH7.5；檢測(cè)緩沖液：100mmolTris-HCl(pH9.5)、100mmolNaCl；抗地高辛的酶標(biāo)抗體：Anti-DIG-AP；CSPD：25mmolCSPD（用前稀釋）；帶正電的尼龍膜為AmershamPharmaciaBiotech公司的產(chǎn)品。挑取CEVd全長(zhǎng)cDNANdeT7RNARNA探1μg4μL5×2μL標(biāo)記dNTPs和2μLT7RNA0.5μLRNA37℃2hRNA方法同B.2。RNA1）取3μLRNA加7μL變性緩沖液(33%甲醛、50%去離子甲酰胺和1×MOPS)，65℃水浴15min，冰浴5min，促使核酸變性；2)然后取變性核酸點(diǎn)于帶正電荷的尼龍膜上，每次3μL，點(diǎn)好后將膜晾干；（Hoefer-Uvc500，AmershamBiosciencesCorp.）1200×100J/cm23min；6×SSC（FisherScientificInternationalInc.）68℃1h；5510h；20mL~40mL2×SSC0.1%SDS5min20mL~40mL0.1×SSC0.1%SDS6815min采用Rochecm2100mL30min；1：1