酶工程學(xué)-第6周酶分離

第四章酶提取與分離純化酶的提取（extraction）與分離（separation,isolation）純化（purification）是將酶從細(xì)胞或其它含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，而獲得所需酶的技術(shù)過程。第一節(jié)細(xì)胞破碎一、機械破碎法通過機械運動所產(chǎn)生的剪切力，使組織細(xì)胞破碎的方法稱為機械破碎法。1.機械搗碎法2.研磨法3.勻漿法二、物理破碎法通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法統(tǒng)稱為物理破碎法。該方法多用于微生物細(xì)胞的破碎。1.溫度差破碎法2.壓力差破碎法3.超聲波破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法三、化學(xué)破碎法應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破壞的方法。1.有機溶劑處理：利用有機溶劑可使細(xì)胞膜的磷質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋放出胞外。2.表面活性劑處理：表面活性劑可以和細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的通透性。四、酶學(xué)破碎法在一定條件下，通過外加的酶或細(xì)胞本身存在的酶的作用，使細(xì)胞破碎。1.外加酶處理：根據(jù)細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)的特點，選用適當(dāng)?shù)拿?，使?xì)胞壁破壞，并在低滲透壓的溶液中使細(xì)胞破裂。2.自溶法：將細(xì)胞在一定的pH和適宜的溫度條件下保溫一段時間，通過細(xì)胞本身存在的酶系將細(xì)胞破壞，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來的方法。G+：溶菌酶酵母：β－葡聚糖酶霉菌：幾丁質(zhì)酶植物細(xì)胞：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶混合使用第二節(jié)酶的提取酶的提?。涸谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程，也稱作酶的抽提。1.鹽溶液提取2.酸溶液提?。阂鹊鞍酌?，0.12MH2SO43.堿溶液提取：L-天冬酰胺酶，pH11－12.54.有機溶劑提?。耗憠A酯酶一、主要方法二、影響酶提取的主要因素1.溫度：0－10℃2.pH3.提取液的體積：原材料的3－5倍4.添加保護(hù)劑：底物、輔酶、抗氧化劑第三節(jié)酶的提取過程中常用的技術(shù)離心是指借助離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)一、離心分離（一）離心機的種類及用途1.常速離心機：<8000r/min,<1x104g2.高速離心機：1x104——2.5x104r/min,1x104——1x105g3.超速離心機：2.5x104——8x104r/min,5x105g（二）離心方法的選擇1.差速離心：采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。2.密度梯度離心：密度梯度的離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離的一種區(qū)帶分離方法。3.等密度離心：當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)時，在離心力的作用下，不同浮力密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏掀?，一直移動到與它們各自浮力密度恰好相等的位置（等密度點），形成區(qū)帶。也叫平衡等密度梯度。介質(zhì)為CsCl,Cs2SO4,CsBr等（三）離心條件的確定1.離心力2.離心時間3.溫度和pH離心力的轉(zhuǎn)換列線圖是通過改變某些條件，使溶液中某種溶質(zhì)的溶解度降低，從而從溶液中沉淀出來，達(dá)到與其他溶質(zhì)分離的目的。

二、沉淀分離1.鹽析沉淀法

2.等電點沉淀法

3.有機溶劑沉淀法

4.復(fù)合沉淀法疏水區(qū)域蛋白質(zhì)分子上的電荷與疏水區(qū)蛋白質(zhì)在等電點的溶解度最小pH與鹽濃度對蛋白質(zhì)溶解度的共同作用三、層析分離（一）什么是層析-chromatography利用混合物中個組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子特性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)等）的不同，使各組分在兩相中的分布程度不同而達(dá)到分離的目的。March21,1903,MeetingoftheWarsawSocietyofNaturalScientists,MikhailSemenovichTswettpresentedalectureentitled"OnaNewCategoryofAdsorptionPhenomenaanditsApplicationinBiochemicalAnalysis".

（二）層析是酶分離提純的好手段疏水區(qū)域蛋白質(zhì)分子上的電荷與疏水區(qū)蛋白質(zhì)在等電點的溶解度最小pH與鹽濃度對蛋白質(zhì)溶解度的共同作用1.吸附層析

2.凝膠層析

3.離子交換層析

4.親和層析（三）常用的層析方式1.凝膠層析又稱分子篩層析，凝膠過濾或分子排阻層析，是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中個組分的相對分子質(zhì)量不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。概念分配系數(shù)KaKa=(Ve-Vo)/V1Ve:洗脫體積Vo:外體積Vt:內(nèi)體積2.親和層析是利用生物分子對之間所具有的專一性而又可逆的親和力使生物分子分離純化的技術(shù)。配體：底物、競爭性抑制劑、輔酶3.離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)對各種離子的親和力不同，而使不同物質(zhì)分離的方法。離子交換劑的選擇陰離子交換劑陽離子交換劑離子交換劑的處理（四）層析系統(tǒng)實驗室用層析柱工業(yè)用層析柱0.5-5cm5-100cm帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。

四、電泳分離1.紙電泳

2.薄層電泳

3.凝膠電泳

4.等電聚焦電泳凝膠電泳以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支持體的電泳技術(shù)。由于凝膠電泳同時具有電泳和分子篩的雙重作用，故具有很高的分辨率。1.連續(xù)凝膠電泳

2.不連續(xù)凝膠電泳

3.濃度梯度凝膠電泳

4.SDS凝膠電泳SDS------------------------等電聚焦電泳是利用組分的等電點不同而進(jìn)行分離的電泳技術(shù)。（1）兩性電解質(zhì)

（2）穩(wěn)定pH梯度

（3）支持pH梯度的介質(zhì)磷酸、硫酸+-NaOH1708年Reuss的實驗1930年Tiselius的裝置最早的電泳裝置1948年分離血清蛋白的工作獲得諾貝爾化學(xué)獎酶以晶體的形式從溶液中析出。

1.一定的純度

2.一定的濃度

3.溫度

4.pH

5.離子強度條件：1.鹽析結(jié)晶法

2.有機溶劑結(jié)晶法

3.滲透平衡結(jié)晶法

4.等電點結(jié)晶法方法：五、酶的結(jié)晶六、酶的濃縮與干燥酶的濃縮：從低濃度酶液中除去部分的水或其他溶劑而成為高