NY/T 549-2002赤羽病細(xì)胞微量中和試驗(yàn)方法

ICS11.220F41NY中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T549-2002赤羽病細(xì)胞微量中和試驗(yàn)方法Cellsmicroneutralizationtestforakabanedisease2002-08-27發(fā)布2002-12-01實(shí)施中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布

NY/T549-2002印赤羽?。╝kabanedisease,又名阿卡斑?。┦怯沙嘤鸩〔《荆╝kabanediseasevirus）引起的牛、綿羊和山羊的一種多型性傳染病。該病以流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、晴形產(chǎn)為特征，能引起先天性關(guān)節(jié)彎曲和積水性無(wú)腦癥。本病的病原是赤羽病病毒，屬布尼病毒科布尼病毒屬，病毒表面有兩種糖蛋白(G1和G),它們分別誘導(dǎo)中和抗體和血凝抑制抗體產(chǎn)生。本病的血清學(xué)診斷方法為細(xì)胞微量中和試驗(yàn)本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：周立橋、李昌琳、封啟民、李其平。

NY/T549-2002赤羽病細(xì)胞微量中和試驗(yàn)方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了赤羽病(akabanedisease)細(xì)胞微量中和試驗(yàn)技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛、羊赤羽病感染的定性以及免疫群體抗體水平的評(píng)估.材料準(zhǔn)備2.16孔細(xì)胞培養(yǎng)物,移液器(50pL.、200%L)滴頭，尤毒透明塑料膠帶，小試管，2.2Vero細(xì)胞或SVP細(xì)胞：2.3抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。2.4被檢血清，無(wú)菌采集·不加防腐劑。3操作方法3.1準(zhǔn)備3.1.1取一支已知滴度的赤羽病病毒(AKV）用199細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成100TCID./50PL，作為工作濃度抗原。3.1.2被檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血消、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清均56（滅活30min,用199液做1：4稀釋(即50l.血消加人15041.199液中）3.1.3按常規(guī)微量中和試驗(yàn)法每個(gè)樣品接種4孔，每孔分別加被檢稀釋血清和工作濃度抗原各50L..輕輕振藝培養(yǎng)板使抗質(zhì)與稀釋血清充分混合·將培養(yǎng)板加蓋貿(mào)37C培養(yǎng)箱內(nèi)中和1h.3.1.4每孔滴加SVP細(xì)胞或Vero細(xì)胞懸液(20萬(wàn)/ml.)100L,用透明塑料膠帶封板，置37C溫箱內(nèi)培養(yǎng).用倒暨顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況(通常72h內(nèi)引起細(xì)胞病變)。3.2對(duì)照設(shè)置每次試驗(yàn)均要設(shè)暨標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血清對(duì)照、病毒對(duì)照、正常細(xì)胞對(duì)照和抗原實(shí)際用量的回歸滴度對(duì)照。3.2.1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血清對(duì)照，將已稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血清分別加人培養(yǎng)板4孔內(nèi)，每孔50PI.，然后各孔加入工作濃度抗原50PL。3.2.2病毒對(duì)照：將工作濃度抗原滴加培養(yǎng)板4孔內(nèi)，每孔50“L,補(bǔ)加細(xì)胞生長(zhǎng)液50L。3.2.3將以上三種對(duì)照置37℃溫箱內(nèi)1h.然后于各孔內(nèi)加人100L細(xì)胞懸液，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)，72h后在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。3.2.4正常細(xì)胞對(duì)照：于培養(yǎng)板4孔內(nèi)各加100PL細(xì)胞懸液，然后再于各孔補(bǔ)加細(xì)胞生長(zhǎng)液100L.3.2.5抗原實(shí)際用量的回歸滴度的測(cè)定：在每次試驗(yàn)中，應(yīng)對(duì)使用的100TCIDa/50I.抗原進(jìn)行實(shí)際用量的測(cè)定，將工作濃度抗原作10倍遞增稀釋到10-,每個(gè)稀釋度接種4孔，每孔50L，立即補(bǔ)加細(xì)胞生長(zhǎng)液50L,置37C溫箱內(nèi)1h,然后每孔加入100L細(xì)胞懸液,計(jì)算該