實驗8-酪氨酸酶動力學(xué)教案資料

實驗(shíyàn)九酪氨酸酶的動力學(xué)第一頁，共11頁。1.學(xué)會(xuéhuì)測定酶反應(yīng)速度的基本方法。2.掌握測定米氏常數(shù)Km值的原理和方法。【目的(mùdì)和要求】第二頁，共11頁。【實驗(shíyàn)原理】酪氨酸酶催化(cuīhuà)的反應(yīng)為：475nm第三頁，共11頁。常用單位時間內(nèi)、產(chǎn)物的濃度(nóngdù)增加量表示。一、酶活力測定(cèdìng)—酶反應(yīng)初速度的測定(cèdìng):TimeProductConcentrationv=dC/dtA=εCd:3600M-1cm-1d:1cm確定(quèdìng)酶反應(yīng)時間！第四頁，共11頁。二、底物(dǐwù)濃度[S]對酶反應(yīng)速度：一級反應(yīng)混合級反應(yīng)零級反應(yīng)Effectofsubstrateconcentrationontheinitialvelocityofanenzyme-catalyzedreaction.?VmaxKm第五頁，共11頁。Km值測定(cèdìng):雙倒數(shù)作圖法第六頁，共11頁。（一）酶反應(yīng)初速度的測定(cèdìng)：---酶反應(yīng)時間的確定在比色杯中，按下表依次(yīcì)加入試劑：【實驗(shíyàn)方法】加入酶液后立即混勻，并每隔15秒讀取475nm處的吸光值。L-多巴（mL）1磷酸緩沖液（mL）1.97酪氨酸酶（mL）0.03注：酪氨酸酶5U/l第七頁，共11頁。繪制產(chǎn)物濃度C-Time反應(yīng)曲線，觀察酶反應(yīng)初速度，確定(quèdìng)酶反應(yīng)時間。一般在30~120秒左右。時刻（秒）A時刻（秒）A0135151503016545180601957521090225105240120255各時刻(shíkè)的吸光值記錄在下表：第八頁，共11頁。（二）米式常數(shù)(chángshù)的測定：在比色杯中(bēizhōnɡ)，采用已確定的酶反應(yīng)時間X，分別記錄各管反應(yīng)開始時A0和X秒鐘后的A1。管號15mML－多巴(ml)磷酸緩沖液（ml）

酪氨酸酶（ml）

10.22.770.0320.32.670.0330.42.570.0340.52.470.0350.62.370.03每管反應(yīng)(fǎnyìng)體系仍為3ml。第九頁，共11頁。記錄(jìlù)數(shù)據(jù)于下表：利用雙倒數(shù)(dǎoshù)作圖法，橫坐標為1/S，縱坐標為1/v，分別求出Vmax和Km。管號L－多巴濃度（mM）A0A1ΔA（A1-A0）V（mM/min）12345第十頁，共11頁?！舅伎碱}】1.

為什么酶活力測