微生物的實驗室培養(yǎng)

課題1微生物的實驗室培養(yǎng)專題2:微生物的培養(yǎng)與應用了解有關微生物及培養(yǎng)基的基礎知識，進行無菌技術的操作，進行微生物的培養(yǎng)。

一、課題目標：掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術，熟練、規(guī)范地進行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術的操作。二、課題重點和難點：三、技能目標：微生物包括哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物特點：結構都相當簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構.且體內一般不含有葉綠素.不能進行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基礎知識：

(一)微生物芽孢有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌.菌落：單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結構的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落細菌的菌落特征因種而異細菌的營養(yǎng)類型

根據(jù)細菌所利用的能源和碳源的不同，將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌:分類,舉例?異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌光合自養(yǎng)型:光合細菌化能自養(yǎng)型:硝化細菌,鐵細菌,硫細菌真菌如圖是酵母菌電子顯微鏡下的形態(tài)結構酵母菌和霉菌青霉

合作探究（10分鐘）重點討論內容：1、培養(yǎng)基的概念2、微生物培養(yǎng)需要的無菌技術3、制備培養(yǎng)基的一般方法（固體）4、接種培養(yǎng)與純化大腸桿菌5、菌落保藏方法6、區(qū)分無土栽培技術、植物組織培養(yǎng)技術與微生物的培養(yǎng)技術任務展示非展示同學1.寫出培養(yǎng)基的定義--培養(yǎng)基的種類－培養(yǎng)基的成分1，

后2，后3，后整理導學案A層做好總結，準備拓展延伸；B層落實基礎知識，提出質疑；C層落實基礎知識2.培養(yǎng)基的環(huán)境條件－什么是消毒及種類－什么是滅菌及種類4,后5，后6，后3.寫出制備培養(yǎng)基的一般方法步驟7，后點評：第8組點評：第9組4.平板劃線法的一般注意事項有哪些？8，后5、稀釋涂布平板法如何稀釋？接種的培養(yǎng)基為何同時與不接種的培養(yǎng)基一起培養(yǎng)？涂布的菌落平均有30個，稀釋了10倍，滴加了0.1mL，則原菌液1mL有多少個細菌？9后10后1后6、菌落保藏方法有哪些？3后5.區(qū)分無土栽培與植物組織培養(yǎng)，微生物培養(yǎng)方法5，后一、基礎知識：（二）培養(yǎng)基

人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質。（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種保存及分離、鑒定菌落、活菌計數(shù)等，液體培養(yǎng)基常用于發(fā)酵工業(yè)。（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型和用途液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔選擇培養(yǎng)基:從微生物群中選擇具有特定表型的細胞.使之進行繁殖所用的培養(yǎng)基,稱為選擇培養(yǎng)基.

加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌

不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物

天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限;成分復雜，影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析;易發(fā)生支原體污染;

根據(jù)細胞生存所需物質的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。

優(yōu)點：標準化生產，組分和含量相對固定;成本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。合成培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基：血清中含有：①多種蛋白質（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉移蛋白⑦不明成分人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方

(參考教材附錄內容)3.不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機鹽、等營養(yǎng)物質，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質,例如:生長因子(即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣等的要求。二、無菌技術1.無菌技術的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學到的倒平板、平板劃線操作，還是稀釋涂布平板法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。

（１）消毒定義：

指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

（2）滅菌的定義：

使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而達到完全無菌之過程。

滅菌消毒技術是微生物有關工作中最普通也是最重要的技術。1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學藥劑消毒法:用75%酒精進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)滅菌的方法：最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。

有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。

1.無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考三、實驗操作

1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）1．計算2．稱量3．溶化4．滅菌5．倒平板操作步驟倒平板技術1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。2、純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法

平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.

在數(shù)次劃線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術平板劃線時不能劃破培養(yǎng)基的原因一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。稀釋涂布平板法問題討論涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？

應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)菌種的保存1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法四、課題成果評價

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。（三）是否進行了及時細致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同本課題知識小結:【典例解析】例1．關微生物營養(yǎng)物質的敘述中，正確的A.是碳源的物質不可能同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽

D.無機氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是A.防止雜菌污染B.消滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前答案：B解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為