第三章細胞生物學研究方法(6學時)匯總

第三章細胞生物學研究方法

細胞生物學研究方法進行初步觀察形成可驗證的假說設計試驗收集資料解釋結果作出合理結論查閱已有知識生物學研究模式生物是基于不同物種享有共同分子機制雖然鯨魚與人類的體型大小差別很大，但是基因卻差別不大，有很多同源基因。CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana第三章細胞生物學研究方法第一節(jié)細胞形態(tài)結構的觀察方法第二節(jié)細胞組分的分析方法第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術第一節(jié)細胞形態(tài)結構的觀察方法

1光學顯微鏡技術（lightmicroscopy）

2

電子顯微鏡技術

(Electromicroscopy)3掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)一、光學顯微鏡技術（lightmicroscopy)

普通復式光學顯微鏡技術

熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術（LaserScanningConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）普通復式光學顯微鏡技術

分辨率是指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離各種顯微鏡的分辨率梯度普通光學顯微鏡樣品一般經(jīng)固定、染色后觀察較厚樣品切片后觀察。普通光學顯微鏡制片技術熒光顯微鏡技術

（FluorescenceMicroscopy）FluorescentMicroscopeObjectiveArcLamp(弧光燈)

EmissionFilterExcitationDiaphragm(光圈)Ocular(目鏡)Excitation

Filter熒光顯微鏡光路圖熒光顯微鏡技術

（FluorescenceMicroscopy）應用

直接熒光標記技術

間接熒光標記技術(免疫熒光標記技術)

FluorescenceMicroscopeimageofHoechststainedcells(plusDIC)Imagecollectedwitha470TOptronicscooledcamera直接熒光標記技術熒光顯微鏡技術

（FluorescenceMicroscopy）應用

直接熒光標記技術

間接熒光標記技術(免疫熒光標記技術)

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應用

應用：綠色熒光蛋白激光共焦掃描顯微鏡技術

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理：FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterObjectiveLaserEmissionPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterConfocalMicroscope普通熒光顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡激光共焦掃描顯微系統(tǒng)(Confocal

System)激光共焦掃描顯微鏡技術

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理：應用： 排除焦平面以外光的干擾，增強 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，通過“光切片”觀察樣品內(nèi)部結構，可重構樣品的三維結構。PineTreepollen-collectedonaBio-RadMRC1024atPurdueUniversityCytometryLaboratories

利用光切片技術顯示的花粉內(nèi)部結構1為轉GFP基因的煙草單細胞；2為轉SCaM1-GFP融合基因的煙草單細胞；3為轉SCaM4-GFP融合基因的煙草單細胞。

質(zhì)壁分離后轉基因煙草單細胞的激光共聚焦顯微鏡觀察細胞壁細胞膜細胞核細胞壁細胞壁細胞膜細胞核細胞膜細胞核細胞核細胞膜細胞壁細胞核細胞膜熒光能量共振轉移（FRET）活體檢測生物大分子的相互作用

蛋白質(zhì)間的相互作用（10nm）受體-供體（CFP-YFP）激發(fā)光，發(fā)射光錢永健2008年NobelFRET就是采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近（1-10nm）時，將光子能從一個受激發(fā)的熒光團（供體）轉移到另一個熒光團（受體）CFP受光激發(fā)后便發(fā)射光CFP受光激發(fā)后但沒有發(fā)射小光。CFP離YFP的距離大于10nmCFP與YFP非常接近（1-10nm）YFP沒有受到激發(fā)，因此也不發(fā)射光CFP沒有受光激發(fā)，但發(fā)射光2008年諾貝爾化學獎

RogerTsien對GFP的機理作出了貢獻。制造了很多GFP突變體。相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）將光程差或相位差轉換成振幅差，可用于觀察活細胞

微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）

偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉化成 明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細胞中較大的細胞器錄像增差顯微鏡技術（video-enhancemicroscopy）

計算機輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活 細胞中的顆粒及細胞器的運動相差顯微技術相差顯微鏡與微分干涉顯微鏡的光路比較以及圖片示例錄像增差顯微鏡技術圖片示例二、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構造

電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理LMEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構造電子束照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)二、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構造

主要電鏡制樣技術

負染色技術冰凍蝕刻技術超薄切片技術電鏡三維重構技術

主要電鏡制樣技術超薄切片技術用于電鏡觀察的樣本制備示意細胞超微結構固定

包埋切片染色超薄切片技術超薄切片技術圖片示例主要電鏡制樣技術

負染色技術（Negativestaining）

用重金屬鹽對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色。襯托出樣品的精細結構，如病毒核糖體等結構。

冷凍蝕刻技術（Freezeetching）

冰凍斷裂與蝕刻復型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結構。

冷凍蝕刻主要電鏡制樣技術

電鏡三維重構技術

電鏡三維重構技術與X-射線晶體衍射技術及核磁共振分析技術相結合，是當前結構生物學（StructuralBiology）主要研究生物大分子空間結構及其相互關系的主要實驗手段。

三維重構技術二、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構造

主要電鏡制樣技術負染色技術冰凍蝕刻技術超薄切片技術電鏡三維重構技術

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

掃描電鏡原理與應用：

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。

CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題掃描電鏡原理與圖片示例三、掃描遂道顯微鏡ScanningTunnelingMicroscope,STM80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結構的儀器。(Nobel獎)反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。特點：分辨率高：

側分辨率：分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達0.001nm不受介質(zhì)限制非破壞性

用途：納米生物學研究領域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結構，觀察生物大分子、膜、病毒等的結構。紅細胞用掃描隧道顯微鏡在高定向裂解石墨表面上刻寫的漢字“中國”，其中筆畫的線條寬度為10nm。用掃描隧道顯微鏡畫出來的中國地圖其比例尺為l∶1013。這是目前世界上最小的中國地圖。如果用這樣大小的漢字來書寫《紅樓夢》一書，只需大頭針針頭那樣小的面積，就可寫進全書的內(nèi)容。

3.特異蛋白抗原的定位與定性

2.細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類的顯示方法

4.細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

5.放射自顯影技術

6.定量化學分析技術

1.離心分離技術第二節(jié)細胞組分的分析方法一、離心分離技術

用途：于分離細胞器與生物大分子及其復合物

差速離心：分離密度不同的細胞組分

密度梯度離心：精細組分或生物大分子的分離差速離心密度梯度離心;連續(xù)密度梯度（等密度沉降）不連續(xù)密度梯度（速度沉降）常用的介質(zhì)：蔗糖、氯化銫、甘油等。

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團特異性結合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量。

FeulgenStaining：DNA

蘇丹染色:脂肪和膽固醇

Millon染色：蛋白質(zhì)

PAS反應：多糖二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)酶、糖與脂類的顯示方法三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術

快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限

免疫熒光技術圖片示例三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術

快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限免疫電鏡技術免疫鐵蛋白技術免疫酶標技術免疫膠體金技術應用：能對蛋白進行精細定位。如通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。

免疫膠體金技術原理與圖片示例三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術

快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限免疫電鏡技術免疫鐵蛋白技術免疫酶標技術免疫膠體金技術應用：能對蛋白進行精細定位。如通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。蛋白電泳(SDS)與免疫印跡反應(Western-Blot)四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術

（同位素標記或熒光素標記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術

（生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結合）

五、放射自顯影技術原理及應用：利用同位素的放射自顯影，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與半定量研究；實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物大分子進行動態(tài)和追蹤研究。步驟：放射性前體分子摻入細胞內(nèi)同位素位置的顯示

六．定量細胞化學分析技術細胞顯微分光光度術（Microspectrophotometry）利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細胞內(nèi)的含量。 包括：紫外光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法

流式細胞儀（FlowCytometry）主要應用：用于定量測定細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量；從細胞群體中分離某些特異染色的細胞；分離DNA含量不同的中期染色體。流式細胞儀原理第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程

1細胞的培養(yǎng)2細胞工程與顯微操作技術一、細胞的培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng) 類型：原代培養(yǎng)細胞（primaryculturecell） 傳代培養(yǎng)細胞（sub-culturecell） 有限細胞系（cellline）40-50代，染色體正常，接觸抑制永生細胞系：染色體改變，接觸抑制喪失，無限傳代細胞株：從細胞中分離單個細胞，具有特殊遺傳標記或性質(zhì)植物細胞培養(yǎng)非細胞體系（cell-freesystem）

Hela細胞（左）、CHO細胞（右）的培養(yǎng)一、細胞的培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)

類型：

單倍體細胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）原生質(zhì)體培養(yǎng)（體細胞培養(yǎng)）

一、細胞的培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)

非細胞體系（cell-fr