微生物的突變和誘變育種

微生物的突變和誘變育種第一頁，共五十七頁，2022年，8月28日第一節(jié)微生物的突變一、基因突變（genemutation）基因突變簡(jiǎn)稱突變，是變異的一類，泛指細(xì)胞內(nèi)（或病毒粒內(nèi)）遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生。突變的幾率一般很低（10-6~

10-9）從自然界分離到的菌株一般稱野生型菌株（wildtypestrain），簡(jiǎn)稱野生型。野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株，稱突變株（mutant，或突變體、突變型）。第二頁，共五十七頁，2022年，8月28日

凡能用選擇性培養(yǎng)基（或其他選擇性培養(yǎng)條件）快速選擇出來的突變株稱選擇性突變株（selectablemutant），反之則稱為非選擇性突變株。（一）突變類型第三頁，共五十七頁，2022年，8月28日1、營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）某一野生菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長(zhǎng)因子、堿基或氨基酸的能力，因而無法再在基本培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)繁殖的變異類型。2、抗性突變型（resistantmutant）指野生型菌株因發(fā)生基因突變，而產(chǎn)生的對(duì)某化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性突變類型。3、條件致死突變型(conditionallethalmutant)某菌株或病毒經(jīng)基因突變后，在某種條件下可正常地生長(zhǎng)、繁殖并呈現(xiàn)其固有的表型，而在另一種條件下卻無法生長(zhǎng)、繁殖的突變類型。第四頁，共五十七頁，2022年，8月28日4、形態(tài)突變型(morphologicalmutant)

指由突變引起的個(gè)體或菌落形態(tài)的變異，一般屬非選擇性突變。5、抗原突變型(antigenicmutant)

指由于基因突變引起的細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生的變異類型，包括細(xì)胞壁缺陷變異、莢膜或鞭毛成分變異等。6、產(chǎn)量突變型(metabolicquantitativemutant)

通過基因突變而產(chǎn)生的在代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株，稱產(chǎn)量突變型。有兩種類型：正變株（plus-mutant）、負(fù)變株（minus-mutant）第五頁，共五十七頁，2022年，8月28日（二）突變率（mutationrate）

某一細(xì)胞（或病毒粒）在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率，稱突變率。（三）基因突變的特點(diǎn)

1.自發(fā)性：各種突變都可在無人為誘變因素處理下自發(fā)發(fā)生；

2.不對(duì)應(yīng)性：突變的性狀與引起的原因間無直接對(duì)應(yīng)關(guān)系；

3.稀有性：自發(fā)突變的幾率極低，一般10-6-10-9，但穩(wěn)定；

4.獨(dú)立性：某一突變既不提高也不降低其他任何基因的突變率；

5.可誘變性：誘變劑可提高突變的幾率，兩種變異株無本質(zhì)差別；

6.穩(wěn)定性：是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)上發(fā)生了穩(wěn)定的變化，穩(wěn)定，可遺傳；

7.可逆性：任何性狀都可發(fā)生正向突變，也都可發(fā)生回復(fù)突變。第六頁，共五十七頁，2022年，8月28日（四）基因突變自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)證明

1、Luria等的變量試驗(yàn)（fluctuationtest）第七頁，共五十七頁，2022年，8月28日2、Newcombe的涂布試驗(yàn)第八頁，共五十七頁，2022年，8月28日3、Lederberg等的影印平板培養(yǎng)法(replicaplating)第九頁，共五十七頁，2022年，8月28日(五)基因突變及機(jī)制第十頁，共五十七頁，2022年，8月28日1、誘發(fā)突變（inducedmutation）

誘發(fā)突變簡(jiǎn)稱誘變，是指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段。凡具有誘變效應(yīng)的任何因素，都稱誘變劑（mutagen）。

1）堿基的置換（substitution）轉(zhuǎn)換(嘌呤間或嘧啶間)

顛換(嘌呤和嘧啶間)

第十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日亞硝酸引起的使A︰T轉(zhuǎn)換成G┇C

過程的簡(jiǎn)式見下圖

HNO2

A:THe:THk+T第一次復(fù)制

A┇THk┇C第二次復(fù)制

G┇C

Hk┇C第十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日①直接引起置換的誘變劑

第十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日②間接引起置換的誘變劑

第十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日2）移碼突變（frame-shiftmutation）

指誘變劑會(huì)使DNA序列中的一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸發(fā)生增添（插入）或缺失，從而使該處后面的全部遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生改變，并進(jìn)一步引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類突變。誘變劑：ICR（美國一癌癥研究所名稱）類化合物：原黃素，吖啶黃，吖啶橙等。誘變機(jī)理：至今不清。結(jié)果：加3、減3；加（減）1，短距離減（加）1；影響小。增（減）1、2、4、5引起后面全變。第十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日常見的致變劑及其致變作用(a)亞硝基的脫氨作用；(b)烷化劑和被甲基化的堿基；(c)5-溴脫氧嘧啶與鳥嘌呤配對(duì)(A=T變G三C)。第十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日

3）染色體畸變（chromosomalaberration）

某些強(qiáng)烈理化因子會(huì)引起DNA分子的大損傷（macrolesion）染色體畸變。既包括染色體結(jié)構(gòu)上的缺失（deletion）、重復(fù)(duplication)、插入(insertion)、易位(translocation)和倒位(inversion)，也包括染色體數(shù)目的變化。轉(zhuǎn)座（因）子：在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段DNA順序。其跳躍過程往往導(dǎo)致DNA鏈的斷裂或重接，產(chǎn)生重組交換、基因啟動(dòng)或關(guān)閉，使突變發(fā)生。轉(zhuǎn)座（因）子主要有三類：IS、Tn、Mu。第十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日2、自發(fā)突變自發(fā)突變（spontaneousmutation）是指生物體在無人工干預(yù)下自然發(fā)生的低頻率突變。自發(fā)突變的原因:1）背景輻射和環(huán)境因素的誘變；2）微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)；3）互變異構(gòu)效應(yīng)；（配對(duì)錯(cuò)誤）4）環(huán)出效應(yīng)。（發(fā)生缺失）第十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日(六)紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶堿基受紫外輻射后產(chǎn)生的衍生物第十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日(六)紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)

1、光復(fù)活作用（photoreactivation）把經(jīng)UV照射后的微生物立即暴露于可見光下時(shí)，就可出現(xiàn)明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，此即光復(fù)活作用。

2、切除修復(fù)（excisionrepair）是活細(xì)胞內(nèi)一種用于對(duì)被UV等誘變劑損傷后DNA的修復(fù)方式之一，又稱暗修復(fù)（darkrepair），這是一種不依賴可見光，只通過酶切作用去除嘧啶二聚體，隨后重新合成一段正常DNA鏈的核酸修復(fù)方式。第二十頁，共五十七頁，2022年，8月28日一、化學(xué)誘變劑

堿基類似物二、物理誘變劑

非電離輻射類因子和電離輻射類因子兩種三、生物誘變劑

（一）轉(zhuǎn)座誘發(fā)突變（二）轉(zhuǎn)化誘發(fā)突變（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)誘發(fā)突變（四）定點(diǎn)誘導(dǎo)第二節(jié)誘發(fā)突變及誘變劑第二十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日第三節(jié)突變體的選擇和檢出一、基因的突變延遲原因：

突變前所產(chǎn)生的物質(zhì)仍然在細(xì)胞中存在活性誘變劑作用在DNA的一條鏈上多核細(xì)胞，所有的核都變?yōu)樽儺惖暮藭r(shí)細(xì)胞才會(huì)表現(xiàn)出來第二十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日二、突變體的篩選（一）隨機(jī)篩選（二）根據(jù)菌落特征或生化反應(yīng)篩選（三）冷敏感菌篩選法（四）梯度平板法（五）營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選第二十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日菌種篩選的策略篩選的手段必需配合不同篩選階段的要求初篩：要力求快速、簡(jiǎn)便復(fù)篩：應(yīng)該做到精確，測(cè)得的數(shù)據(jù)要能夠反映將來的生產(chǎn)水平(1)從菌體形態(tài)變異分析——初篩有些菌體的形態(tài)變異與產(chǎn)量的變異存在著一定的相關(guān)性，在篩選工作中應(yīng)盡可能捕捉、利用這些直接的形態(tài)特征性變化。

第二十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日

平皿快速檢測(cè)法平皿快速檢測(cè)法是利用菌體在特定固體培養(yǎng)基平板上的生理生化反應(yīng)，將肉眼觀察不到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成可見的“形態(tài)”變化。紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長(zhǎng)圈法和抑制圈法等?！ㄐ曰虬攵坑?，大大提高篩選的效率——初篩第二十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日微生物特異性平板檢測(cè)方法第二十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片變色圈指示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物質(zhì)形成透明圈。利用一些有特別營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，如待篩選菌具有該營養(yǎng)物的前體轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物能力，工具菌就能圍繞該菌生長(zhǎng)待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長(zhǎng)的物質(zhì)第二十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日

搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法是將待測(cè)菌株的單菌落分別接種到三角瓶培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，然后，再對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行分析測(cè)定。特殊變異菌的篩選方法營養(yǎng)缺陷型突變株抗阻遏和抗反饋突變型抗生素抗性突變株條件抗性突變第二十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日營養(yǎng)缺陷型突變株濃縮、進(jìn)一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。篩選步驟：

濃縮營養(yǎng)缺陷型菌株常用的濃縮方法有抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法等。目的：淘汰大量野生型，使?fàn)I養(yǎng)缺陷型占的比例增加第二十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日

進(jìn)一步檢出所需缺陷型逐個(gè)檢出法影印培養(yǎng)法第三十頁，共五十七頁，2022年，8月28日一般從菌落大小也可以判斷，新長(zhǎng)出的菌落較小，即是營養(yǎng)缺陷型夾層培養(yǎng)法

營養(yǎng)缺陷型的鑒定獲得的營養(yǎng)缺陷型菌株還應(yīng)進(jìn)一步確認(rèn)其生長(zhǎng)的所需物。生長(zhǎng)譜法

組合補(bǔ)充培養(yǎng)基法第三十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日營養(yǎng)缺陷型的應(yīng)用

利用營養(yǎng)缺陷型突變株來生產(chǎn)氨基酸和核苷酸是典型的例子第三十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日天冬氨酸激酶(AK)被賴氨酸及蘇氨酸協(xié)同反饋所抑制通過誘變處理，獲得高絲氨酸缺陷型突變菌株，該突變型不能產(chǎn)生蘇氨酸。在限量高絲氨酸的培養(yǎng)基中缺陷型菌株能夠正常生長(zhǎng)，并且因?yàn)橄朔答佉种仆蛔冃湍苓^量生產(chǎn)L-賴氨酸第三十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日抗阻遏和抗反饋突變型抗阻遏和抗反饋突變型都是由于代謝失調(diào)所造成的，在細(xì)胞中已經(jīng)有大量最終代謝產(chǎn)物時(shí)仍然繼續(xù)不斷地合成這一產(chǎn)物。選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株結(jié)構(gòu)類似物是指一些和細(xì)菌體內(nèi)氨基酸、嘌呤、維生素等代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相類似的物質(zhì)主要用于末端產(chǎn)物的積累第三十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日抗性突變菌株的篩選抗生素抗性突變株

在抗生素產(chǎn)生菌選育中，通過篩選抗生素抗性突變可提高抗生素產(chǎn)量。

抗生素抗性突變株除能提高抗生素的產(chǎn)量外，還能提高其它代謝產(chǎn)物的量。條件抗性突變

因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為"野生型"菌株的特性和突變型菌株特性的突變稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。溫度敏感突變常用于提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量致死營養(yǎng)缺陷第三十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日抗性突變菌株的篩選方法

一次性篩選法一次性篩選法就是指在對(duì)出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株。噬菌體抗性菌株耐高溫菌株第三十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日

階梯性篩選法梯度平板法第三十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日紙片擴(kuò)散法用打孔器將較厚的濾紙（如新華六號(hào)）打成小圓片，并使紙片吸收一定濃度的藥物，經(jīng)干燥或不經(jīng)干燥，放入涂布了菌懸液的平板上，一般9厘米的培養(yǎng)皿中等距放置三片為宜。經(jīng)培養(yǎng)后觀察圍繞紙片的抑菌圈，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)的可能就是抗性菌。組成酶變異株的篩選誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）會(huì)引起酶合成的減少，誘導(dǎo)物有時(shí)又比較昂貴。生產(chǎn)成本提高第三十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日控制酶合成的調(diào)節(jié)基因發(fā)生了變異誘導(dǎo)酶轉(zhuǎn)變成組成型酶具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法

恒化器法：恒化器常被用于微生物的“馴化”，添加不能起誘導(dǎo)作用的低濃度底物，緩慢生長(zhǎng)

循環(huán)培養(yǎng)法：利用不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。誘導(dǎo)抑制劑法：加入誘導(dǎo)抑制劑如α-硝基苯基-β-巖藻糖苷阻止某些誘導(dǎo)酶的合成第三十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日1、誘變育種的基本環(huán)節(jié)第四節(jié)微生物誘變育種第四十頁，共五十七頁，2022年，8月28日1）選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株（originalstrain）3）處理單細(xì)胞或單孢子懸液4）選用最適的誘變劑量5）充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)（synergism）6）利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)7）設(shè)計(jì)高效篩選方案（篩選比誘變更重要）8）創(chuàng)造新型篩選方法2、誘變育種中的幾個(gè)原則第四十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日1）產(chǎn)量突變株的篩選如：瓊脂塊培養(yǎng)法2）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選①與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的3類培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、補(bǔ)充培養(yǎng)基②與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的3類遺傳個(gè)體

野生型(A+B+)、營養(yǎng)缺陷型(A+B-)、原養(yǎng)型(A+B+)③營養(yǎng)缺陷型突變株的應(yīng)用

基本理論:代謝途徑、基因重組規(guī)律的標(biāo)記菌種。

應(yīng)用研究:生產(chǎn)核苷酸、氨基酸，工程菌株的親本。3、

三類突變株的篩選方法第四十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日第四十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日第一步：誘變劑處理第二步：淘汰野生型抗生素法（細(xì)菌）、菌絲過濾法（真菌）第三步：檢出缺陷型夾層培養(yǎng)法、限量補(bǔ)充培養(yǎng)法（觀大?。┲饌€(gè)檢出法（兩種培養(yǎng)基）、影印平板法第四步：鑒定缺陷型生長(zhǎng)譜法（auxanography）④營養(yǎng)缺陷型的篩選方法第四十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日

3）抗藥性突變株的篩選梯度平板法：

如：選育抗異煙肼的吡哆醇高產(chǎn)菌株突變株：

①產(chǎn)生了可分解異煙肼的酶；②能合成更高濃度的吡哆醇．（多）獲突變酵母的吡哆醇產(chǎn)量提高７倍．方法：

10mL普通培養(yǎng)基→斜放→凝固→平放→10mL藥物培養(yǎng)基→凝固→涂誘變酵母→選厚藥區(qū)菌落→檢驗(yàn)第四十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日體內(nèi)基因重組育種接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和原生質(zhì)體融合等遺傳學(xué)方法和技術(shù)使微生物細(xì)胞內(nèi)發(fā)生基因重組1.原生質(zhì)體融合將遺傳性狀不同的兩種菌(包括種間、種內(nèi)及屬間)融合為一個(gè)新細(xì)胞的技術(shù)。選擇親株、原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的融合、原生質(zhì)體再生和融合子選擇等步驟步驟第四十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日微生物原生質(zhì)體融合的一般原理和過程第四十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日

選擇親株

選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的兩個(gè)親株

為了能明確檢測(cè)到融合子，參與融合的親株一般都需要帶有可以識(shí)別的遺傳標(biāo)記，如營養(yǎng)缺陷型或抗藥性等原生質(zhì)體制備

去除細(xì)胞壁是制備原生質(zhì)體的關(guān)鍵第四十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日

革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成溶菌酶微球菌、枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌革蘭氏陰性菌不能直接溶壁，只有當(dāng)乙二胺四乙酸（EDTA）存在時(shí)，某些革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁才能夠被溶菌酶溶解。金黃色葡萄球菌溶菌酶不能溶解表皮葡萄球菌能產(chǎn)生一種內(nèi)肽酶——葡萄球菌素，溶解第四十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌也可采用溶菌酶真菌細(xì)胞壁主要由纖維素、幾丁質(zhì)和葡聚糖等組成青霉菌多用纖維素酶和-1,3-糖苷酶等溶壁曲霉用-1,3-糖苷酶和-1,4-糖苷酶等酵母菌細(xì)胞壁中的葡聚糖和幾丁質(zhì)蝸牛酶第五十頁，共五十七頁，2022年，8月28日第五十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日

培養(yǎng)基中添加甘氨酸，可以使菌體較容易被酶解在菌體生長(zhǎng)階段添加蔗糖也能提高細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性在菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期加入適量青霉素，就能使細(xì)胞對(duì)溶菌酶更敏感菌齡：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期細(xì)胞的細(xì)胞壁中肽聚糖含量很低，對(duì)溶菌酶敏感。原生質(zhì)體制備的其他因素：一般是將原生質(zhì)體放在高滲的環(huán)境中以維持它的穩(wěn)定性第五十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日原生質(zhì)體融合聚乙二醇（PEG）能有效地促進(jìn)原生質(zhì)體融合一般PEG的使用濃度范圍在25-40%采用電