微生物的菌種選育

微生物的菌種選育第一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日5.2.2基因突變和誘變育種第二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日基因突變誘變育種第三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日一、基因突變（genemutation）一個基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變簡稱突變，是變異的一種，泛指細胞內(nèi)（或病毒粒內(nèi)）遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導產(chǎn)生。突變幾率一般很低（10-6～10-9）第四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日從自然界分離到的菌株，簡稱野生型。

野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株，又稱突變體或突變型。突變株（mutant）野生型菌株（wildtypestrain）第五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（一）突變類型凡能用選擇性培養(yǎng)基（或其他選擇性培養(yǎng)條件）快速選擇出來的突變株。選擇性突變株（selectivemutant）非選擇性突變株（non-selectivemutant）反之。第六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日表型基因型這里主要介紹幾種常用的由于基因突變而造成微生物表型變化的突變型及其分離第七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日link1突變株的表型非選擇性突變株選擇性突變株抗性突變型（株）營養(yǎng)缺陷型（株）條件致死突變型（株）形態(tài)突變型（株）抗原突變型（株）產(chǎn)量突變型（株）第八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日突變率每一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率例如，突變率為10-8的，指該細胞在1億次細胞分裂中，會發(fā)生1次突變。某一單位群體在每一世代（即分裂1次）中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示例如，一個含108個細胞的群體，當其分裂為2×108個細胞時，即可平均發(fā)生一次突變的突變率也是10-8。（二）突變率（mutationrate）第九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日第十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日突變一般是獨立發(fā)生的。某一基因發(fā)生突變不會影響其他基因的突變率。同一細胞中同時發(fā)生兩個基因突變的幾率是極低的。第十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（三）基因突變的特點基因突變的7個共同點（1）自發(fā)性各種性狀的突變，可在無人為的誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。第十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（2）非對應性突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對應關(guān)系。這是突變的一個重要特點，也是容易引起爭論的問題（3）稀有性自發(fā)突變雖可隨時發(fā)生，但其突變率卻是極低和穩(wěn)定的，一般在10-6～10-9間。第十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日某基因的突變率不受它種基因突變率的影響。（5）可誘變性自發(fā)突變的頻率可因誘變劑（mutagen）的影響而大為提高（10～105倍）。（4）獨立性第十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日基因突變后的新遺傳性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。野生型菌株某一性狀可發(fā)生正向突變（forwardmutation），也可發(fā)生相反的回復突變（reversemutation或backmutation

，也稱回變）。（7）可逆性（6）穩(wěn)定性第十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（四）基因突變自發(fā)性和不對應性

的實驗證明如何證明基因突變的非對應性？第十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對應關(guān)系！三個經(jīng)典實驗變量實驗、涂布實驗、影印實驗第十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日1.變量試驗（fluctuationtest）又稱波動試驗或彷徨試驗。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根據(jù)統(tǒng)計學的原理，設計實驗。SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969甲管乙管第十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日2.涂布試驗（Newcombeexperiment）1949年，在《NATURE》上發(fā)表了一篇與變量試驗屬同一觀點的但實驗方法更為簡單的涂布試驗結(jié)果。第十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日3.平板影印培養(yǎng)試驗（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫婦發(fā)表了一篇著名的《平板影印培養(yǎng)法和細菌突變株的間接選擇》論文，它更好地證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發(fā)地產(chǎn)生的，這一突變與相應的藥物環(huán)境毫不相干。第二十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日影印的作用是保證這3個平板上所長出的菌落的親緣和相對位置保持嚴格的對應性。第二十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958第二十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（五）基因突變及其機制僅影響一對堿基影響一段染色體第二十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日

誘發(fā)突變簡稱誘變，是指通過人為的方法，利用物理、化學或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段。1.誘發(fā)突變（inducedmutation）凡具有誘變效應的任何因素，都稱誘變劑（mutagen）。第二十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日(1)堿基的置換（substitution）堿基的置換只涉及一對堿基被另一對堿基所置換，屬于典型的點突變（pointmutation）。染色體的微小損傷（microlesion）第二十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日堿基的置換轉(zhuǎn)換（transition）顛換（transversion）一個嘌呤另一個嘌呤一個嘧啶另一個嘧啶一個嘌呤另一個嘌呤一個嘧啶另一個嘧啶第二十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日第二十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日(2)移碼突變（frame-shiftmutation，phase-shiftmutation）指誘變劑使DNA序列中的一個或少數(shù)幾個核苷酸發(fā)生增添（插入）或缺失，從而使其后面的全部遺傳密碼發(fā)生閱讀框發(fā)生改變，并進一步引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的一類突變。第二十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日由吖啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復突變圖示：（雙線部分代表正常密碼子，單線部分表示不正常）①正常DNA鏈上的三聯(lián)密碼子：②第三個密碼子中增添一個堿基后的三聯(lián)密碼子：第二十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日③在第二個密碼子上缺失一個堿基A后引起的變化：④增添一個堿基和缺失一個堿基后，其后的密碼子又恢復正常：第三十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日⑥如缺失三個堿基，也只引起一段密碼子不正常：⑤增添三個堿基后，只引起一段密碼子不正常：第三十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日(3)染色體畸變（chromosomalaberration）電離輻射（X射線等）烷化劑亞硝酸等某些強烈理化因子引起點突變DNA的大損傷（macrolesion）第三十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日DNA的大損傷（macrolesion）染色體畸變?nèi)笔В╠eletion）重復（duplication）插入（insertion）易位（translocation）倒位（inversion）染色體結(jié)構(gòu)上染色體數(shù)目的變化第三十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日2.自發(fā)突變（spontaneousmutation）

自發(fā)突變（spontaneousmutation）是指生物體在無人工干預下自然發(fā)生的低頻率突變。第三十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日自發(fā)突變的原因（1）背景輻射和環(huán)境因素（3）DNA復制過程中堿基配對錯誤（2）微生物自身有害代謝產(chǎn)物一個1000bp的基因自發(fā)突變頻率約為10-6例如，過氧化氫等例如，天然的宇宙射線等第三十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（六）紫外線對DNA的損傷及其修復嘧啶（敏感性）＞嘌呤紫外線（ultravioletray，U.V.）嘧啶二聚體（TT，TC，CC）和水合物第三十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日第三十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日把經(jīng)UV照射后的微生物立即暴露于可見光下時，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復活作用。1.光復活作用（photoreactivation，photorestoration）最早是A.Kelner（1949）在Streptomycesgriseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)現(xiàn)的。后來，在許多微生物中都得到了證實。第三十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日最明顯的是在E.coli的實驗①對照：8×106個／mLE.coli→100個／mLE.coli②試驗：8×106個／mLE.coli→－－－－→2×106個／mLE.coliUVUV360～490nm可見光，30min第三十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日使二聚體（dimer）重新分解成單體（monomer）帶有嘧啶二聚體的DNA分子DNA分子UV照射黑暗下結(jié)合光激活酶——光解酶（光裂合酶，photolyase）復合物300～500nm可見光獲得光能而激活釋放光解酶第四十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日在一般的微生物中都存在光復活作用，在利用UV進行誘變育種等工作時，應在紅光下進行照射和后續(xù)操作，并放置在黑暗條件下培養(yǎng)。注意第四十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日2.切除作用（excisionrepair）是活細胞內(nèi)一種用于修復被UV等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后DNA的修復方式之一，又稱暗修復（darkrepair），通過酶切作用去除嘧啶二聚體，隨后重新合成一段正常DNA鏈的核酸修復方式。第四十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日酶切合成切開切除聚合連接第四十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日二、突變與育種

（一）自發(fā)突變與育種

（breedingbyspontaneousmutation）

1.從生產(chǎn)中育種在生產(chǎn)第一線易獲得較優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。第四十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日2.定向培育優(yōu)良菌株定向培育是一種利用微生物自發(fā)突變，并采用特定的選擇條件，通過對微生物群體不斷移植以選育出較優(yōu)良菌株的古老方法。第四十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（二）誘變育種（breedingbyinducedmutation）

誘變育種是指利用物理、化學等誘變劑處理均勻而分散的微生物細胞群，在促進其突變率顯著提高的基礎上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合育種目的的突變株，以供科學實驗或生產(chǎn)實踐使用。第四十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日篩選誘變誘變育種定向的——更重要隨機的第四十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日可獲得供工業(yè)和實驗室應用的各種菌株；提高有用代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量；減少雜質(zhì)、提高產(chǎn)品質(zhì)量、擴大品種和簡化工藝等。誘變育種具有重大的實踐意義第四十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日誘變育種的特點（1）提高突變率，擴大突變譜（2）有效地改良個別、單一性狀（3）縮短育種年限（4）定向變異和有益突變的頻率低第四十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日出發(fā)菌株純化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液離心收集細胞，洗滌，制菌懸液玻璃珠打散，過濾細胞或孢子懸液誘變處理平板分離初篩復篩保藏及擴大試驗活菌計數(shù)，誘變預備試驗存活細胞計數(shù)，致死率計算變異率計算1.誘變育種的基本過程第五十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日2.誘變育種中的原則

（1）選擇簡便有效的誘變劑誘變劑（mutagen）物理因素化學誘變劑非電離輻射類的紫外線、激光和離子束（ionbeam，有小型加速器提供）等引起電離輻射的X射線、γ射線和快中子等主要有烷化劑、堿基類似物和吖啶類化合物第五十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日

烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接發(fā)生反應，更易引起基因突變。最常用的烷化劑N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基亞硝基脲（NMU）、硫酸二乙酯（DES）、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙烷等。第五十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日擬輻射物質(zhì)氮芥、硫芥和環(huán)氧乙烷等各種點突變一般只有輻射才能誘發(fā)的染色體畸變誘發(fā)第五十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日

出發(fā)菌株（originalstrain）是指用于育種的原始菌株，選用合適的出發(fā)菌株有利于提高育種的效率。（2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株第五十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日合適的出發(fā)菌株來源：①由自然界直接分離獲得的野生型菌株；②在生產(chǎn)中經(jīng)歷生產(chǎn)條件考驗的菌株；③已經(jīng)過誘變甚至多次改造的菌株；④選用對誘變劑敏感性較高增變變異株；等等。第五十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日在誘變育種中，所處理的細胞必須是單細胞、均勻的懸液狀態(tài)。（3）處理單細胞或單孢子懸液菌懸液制備目的在于提高誘變處理的效果因為:一方面，分散狀態(tài)的細胞可以均勻地接觸誘變劑，另一方面，又可避免長出不純菌落。第五十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日誘變劑的作用有三條：一是提高誘變的頻率二是擴大變異的幅度三是使變異向正變的方向移動（產(chǎn)量提高）（4）選用最適的誘變劑量第五十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日誘變劑的復合處理常常表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應，這對育種工作是有利的。（5）充分利用復合處理的協(xié)同效應（synergism）第五十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日第五十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日復合處理有幾類：①兩種或多種誘變劑的先后使用；②同一種誘變劑的重復使用；③兩種或多種誘變劑的同時使用。第六十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日為了大大提高育種時初篩的效率，必須進行大量的分析測定和統(tǒng)計工作，并找到形態(tài)變異與產(chǎn)量變異兩者間的相關(guān)性。（6）利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標第六十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日利用鑒別性培養(yǎng)基的原理或其他途徑，就可有效地把原先肉眼無法觀察的生理性狀或產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化為可見的“形態(tài)”性狀?？焖倨桨鍣z出法第六十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日在瓊脂平板上，通過觀察測定某突變菌落周圍蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶變色圈（用碘液使淀粉顯色）的大小，氨基酸顯色圈（將菌落用打孔機取下，轉(zhuǎn)移到濾紙上，再用茚三酮試劑顯色）的大小，檸檬酸變色圈（可在厚濾紙上培養(yǎng)，用溴甲酚綠作指示劑）的大小，抗生素抑制圈的大小，指示菌生長圈的大?。y定生長因子產(chǎn)生），纖維素酶對纖維素水解圈（用剛果紅染色）的大小，外毒素的沉淀反應圈的大小等，均可為初篩工作中估計某突變株代謝產(chǎn)物量的“形態(tài)”指標。第六十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（7）設計高效篩選方案設計簡便、高效的科學篩選方案。初篩篩選工作復篩以量為主（選留較多有生產(chǎn)潛力的菌株）以質(zhì)為主（對少量潛力大的菌株的代謝產(chǎn)物量作精確測定）第六十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日常用的篩選方案第一輪：第二輪：第三輪： 同第二輪第四輪： 同上

... 直至獲得較滿意的結(jié)果為止第六十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日初篩復篩對產(chǎn)量突變株生產(chǎn)性能的測定方法粗測為主在培養(yǎng)皿平板上在搖瓶中（8）創(chuàng)造新型篩選方法較精確的測定搖瓶培養(yǎng)or臺式自控發(fā)酵罐培養(yǎng)第六十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日3.3類突變株的篩選方法

（1）產(chǎn)量突變株的篩選1971年，國外有人報道了篩選春日霉素（kasugamycin，即“春雷霉素”）生產(chǎn)菌時所采用的一種瓊脂塊培養(yǎng)法，一年內(nèi)曾使該抗生素產(chǎn)量提高10倍。第六十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日此法的關(guān)鍵是用打孔器取出含有一個小菌落的瓊脂塊作分別培養(yǎng)。這樣，各瓊脂塊所含養(yǎng)料和接觸空氣面積基本相同，且產(chǎn)生的抗生素等代謝產(chǎn)物不致擴散出瓊脂塊外。數(shù)據(jù)精確，效率高第六十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（2）抗藥性突變株的篩選基因突變使菌株對某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性。特點：正選擇標記（突變株可直接從抗性平板上獲得-----在加有相應抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。）第六十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日梯度平板法（gradientplate）是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法，通過制備瓊脂表面存在藥物濃度梯度的平板、在其上涂布誘變處理后的細胞懸液、經(jīng)培養(yǎng)后再從其上選取抗藥性菌落等步驟，就可定向篩選到相應抗藥性突變株。第七十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日梯度平板法（gradientplate）是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法。第七十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日表示方法：所抗藥物的前三個小寫斜體英文字母加上“r”。strrstrs對鏈霉素的抗性敏感性第七十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型突變株（auxotrophicmutant）在生物學基礎理論和應用研究以及生產(chǎn)實踐上都有極其重要的意義。第七十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日a.基本培養(yǎng)基（MM，符號為［－］）①

與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的3類培養(yǎng)基僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需的最低成分的組合培養(yǎng)基，稱MM。第七十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日b.完全培養(yǎng)基（completemedium，CM，符號為［＋］）凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基，稱為CM。一般可在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素、核苷酸和堿基之類的天然物質(zhì)，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。第七十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日c.補充培養(yǎng)基（supplementalmedium，SM，符號為［A］或［B］等）凡只能滿足相應的營養(yǎng)缺陷型突變株生長需要的組合或半組合培養(yǎng)基，稱為SM。在基本培養(yǎng)基上再添加對某一營養(yǎng)缺陷型突變株所不能合成的某相應代謝產(chǎn)物所組成，可專門選擇相應的突變株。第七十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日原養(yǎng)型（prototroph）②

與營養(yǎng)缺陷型突變有關(guān)的3類遺傳型個體野生型（wildtype，wildstrain）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）從自然界分離到的原始菌株（A＋B＋）經(jīng)誘變劑處理后的突變株（A—B—）經(jīng)回復突變或重組后產(chǎn)生的菌株（A＋B＋）第七十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日③

營養(yǎng)缺陷型的篩選方法第一步，誘變劑處理第二步，淘汰野生型第三步，檢出缺陷型第四步，鑒定缺陷型第七十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日淘汰野生型的方法（1）抗菌素法青霉素制霉菌素（2）菌絲過濾法第七十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日第三步，檢出缺陷型對照培養(yǎng)法夾層培養(yǎng)法（layerplatingmethod）限量補充培養(yǎng)法逐個檢出法影印平板法第八十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日①對照培養(yǎng)法CMMMSM②夾層培養(yǎng)法MMCMMM＋菌液第八十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日③影印法CMMM④限量補充培養(yǎng)法⑤逐個檢出法第八十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日第四步，鑒定缺陷型借助生長譜法（auxanography）進行。第八十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日營養(yǎng)缺陷型的鑒定－生長譜法營養(yǎng)組合編號組合營養(yǎng)因子A1,2,3,4,5B2,6,7,8,9C3,7,10,11,12D4,8,11,13,14E5,9,12,14,15第八十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日ABECD缺13ECDBA缺2ABECD單獨A或B均不能滿足BECDA缺1濃度太大第八十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日第八十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日1.營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）

某一野生型菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，只有從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營養(yǎng)或其前體物（precursor）才能正常生長繁殖的變異類型，稱為營養(yǎng)缺陷型。第八十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日營養(yǎng)缺陷型突變株在遺傳學、分子生物學、遺傳育種和遺傳工程等研究中——十分重要表型判斷的標準：在基本培養(yǎng)基上能否生長第八十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日營養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營養(yǎng)物的前三個英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個字母大寫，且不用斜體：HisC第八十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日hisC－缺陷型hisC＋野生型第九十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日2.抗性突變型（resistantmutant）指野生型菌株因發(fā)生基因突變，使菌株對對某化學藥物或致死物理因子，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性的抗性變異類型