血液樣本的收集與保存

血液樣本的收集與保存全血根據收集的條件，分成不抗凝和抗凝兩種。同時，不抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱之為血清；抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱之為血漿。標本的存放溫度及時間，血清、血漿及細胞分離的方法步驟也是分析前影響檢驗結果的重要因素。抽血后，血細胞因代謝需要，要消耗掉部分營養(yǎng)成分，故對這些成分進行測定時，需及時地離心以分離掉細胞成分。采血前個體的準備情況，如空腹時間的長短、采樣時間的確定及采血時患者的姿勢；止血帶應用時間，輸液情況，體育運動，抗凝劑及穩(wěn)定劑的選用；標本的處理等均可影響到某些檢驗指標的水平。故標本采集過程應標準化，以最大限度地減少分析前誤差。一、不抗凝收集血清：1、無添加劑的干燥空管收集:血管內壁均勻涂有防止掛壁的藥劑(硅油)。它利用血液自然凝固的原理使血液凝固，等血清自然析出后，離心使用。主要用于血清生化(肝功、腎功、心肌酶、淀粉酶等)、電解質(血清鉀、鈉、氯、鈣、磷等)、甲狀腺功能、藥物檢測、艾滋病檢測、腫瘤標志物、血清免疫學檢測。

亦可直接用干燥EP管收集全血，充分靜置使得紅細胞充分自然凝固后，離心分離出血清待用或保存。2、用促凝管收集:采血管內壁均勻涂有防止掛壁的硅油，同時添加了促凝劑。促凝劑能激活纖維蛋白酶，使可溶性纖維蛋白變成不可溶性的纖維蛋白聚體，進而形成穩(wěn)定的纖維蛋白凝塊，如果想快點出結果時，可采用促凝管。一般靜置半小時到1小時，直接離心分離出血清待用或保存,常用于急診生化。3、含有分離膠及促凝劑的采血管收集：管壁經過硅化處理，并涂有促凝劑可加速血液的凝固，縮短檢驗時間。管內加有分離膠，分離膠與PET管具有很好的親和性，確實起到隔離作用，一般即使在普通離心機上，分離膠能將血液中的液體成分(血清)和固體成分(血細胞)徹底分開并積聚在試管中形成屏障。離心后血清中不產生油滴，主要用于血清生化(肝功、腎功、心肌酶、淀粉酶等)、電解質(血清鉀、鈉、氯、鈣、磷等)、甲狀腺功能、藥物檢測、艾滋病檢測、腫瘤標志物、血清免疫學。

用促凝管的優(yōu)點：①、加速紅細胞的凝固，無需長時間的靜置；②、帶有分離膠，有效的將血清分離出來，更好的避免溶血；

收集血清的缺點：①、需要紅細胞的充分凝固，所需靜置時間較長；②、分離出的血清相對較少，1ml全血不抗凝約只能分離出0.2-0.3ml血清。二、抗凝收集血漿：收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，可直接離心分離血漿待用或保存。根據不同抗凝劑的性能特征，選擇合適的抗凝劑。實驗室常用的抗凝劑有肝素的各種鹽、EDTA及枸櫞酸鈉。

1、肝素抗凝：最常用的抗凝劑，一般情況下對相關指標都不會有干擾，同時抗凝比例較大（抗凝劑：全血=1:30），對血液基本沒有稀釋影響。肝素是一種含有硫酸基團的粘多糖，帶有強大的負電荷，具有加強抗凝血酶III滅活絲氨酸蛋白酶的作用，從而阻止凝血酶的形成，并有阻止血小板聚集等多種抗凝作用。肝素管一般用于生化及血流變的檢測，是電解質檢測的最佳選擇，檢驗血標本中的鈉離子時，不能使用肝素鈉，以免影響檢測結果。也不能用于白細胞計數和分類，因肝素會引起白細胞聚集。盡管用肝素的三種鹽抗凝所得電解質濃度無顯著差別，但肝素鋰還是被認為是最好的。這主要是人們認為肝素鈉可使鈉的測定值偏高，肝素銨可使血氨測定值偏高（尿素酶法測定）。肝素可抑制分子生物學中常用的一些工具酶，如限制性內切酶、Taq酶等，可影響PCR的實驗結果?？刹捎靡恍┓椒ㄏ嗡氐囊种菩?，如利用肝素酶，或在分離白細胞后用緩沖液洗滌白細胞兩次以上等。然而，許多實驗工作者仍不愿意在進行分子生物學實驗時采用肝素作抗凝劑。2、EDTA抗凝：乙二胺四乙酸是一種氨基多羧基酸，可以有效地鰲合血液中的鈣離子，鰲合鈣會將鈣從反應點移走將阻止和終止內源性或外源性凝血過程，從而防止血液凝固，與其他抗凝劑比較而言，其對血球的凝集及血細胞的形態(tài)影響較小，故通常使用EDTA鹽(2K、3K、2Na)作為抗凝劑。用于一般血液學檢查，不能用于血凝、微量元素及PCR檢查。

由于EDTA會螯合重金屬離子，用該抗凝劑的話，部分帶有金屬離子的大分子酶都會有大量損失，具體看客戶測定的指標來選擇，做血常規(guī)的話必須用EDTA抗凝。

3、枸櫞酸鹽抗凝:檸檬酸鈉通過作用于血樣中鈣離子鰲合而起抗凝作用，國家臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦為3.2％或3.8％，抗凝劑與血比例為1：9，主要用于纖溶系統(tǒng)(凝血酶原時間、凝血酶時間、活化部分凝血酶時間、纖維蛋白原)。采血時應注意采足血量，以保證檢驗結果的準確性，采血后應立即輕輕顛倒混勻5-8次。由于抗凝比例較小（抗凝劑：全血=1:9），對血液有一定的稀釋，一般不建議。選擇抗凝的注意點：①、每一份樣本所加的抗凝劑的量要一致，同時所取的全血的量也要盡量一致;②、收集抗凝全血后一定要輕輕顛倒，充分抗凝，防止部分血液未接觸到抗凝劑而導致凝固;

③、抗凝全血收集的血漿相對較多（1ml抗凝全血能分離出0.4-0.5ml血漿）;

④、抗凝收集的血漿冷凍保存后，解凍時可能會出現絮狀渾濁，如有則需要離心去掉渾濁后用于測定。

血清、血漿收集好后，暫時不測定，可立即低溫凍存，溫度越低越好，中間如不反復凍融，-20℃以下可保存一個月,-70℃以下可保存三個月。

三、收集血清、血漿所用離心轉速：

分離血清或血漿，根據種屬不同，離心轉速也有差異,推薦離心轉速為:

①、小鼠：一般1000-1500轉/分，離心8-10分鐘；②、大鼠、兔子：一般2000-2500轉/分，離心8-10分鐘；③、人：一般2500-3000轉/分，離心8-10分鐘。四、高脂及溶血因素的影響:溶血的影響:溶血對某些檢驗指標的的影響不僅取決于所采用的方法，也取決于所用的分析儀器。采用雙波長測定法可在一定程度上消除Hb的顏色干擾，然而Hb的干擾并不能完全消除，尤其是當Hb可以與采用的試劑發(fā)生作用時?？偟膩碚f，輕微的溶血，對大多數臨床化學指標的測定方法無明顯干擾。嚴重的溶血，可能有兩方面的影響：（1）測定成分在紅細胞內的濃度高于血漿時，導致測定結果偏高；（2）測定成分在RBC內濃度低于血漿時，產生輕微的稀釋效應。用肉眼觀察標本是否溶血只能是粗略的判斷。只有當血清中血紅蛋白濃度超過20mg/dl時，肉眼才能見到溶血情況。有人報導0.1％的紅細胞發(fā)生溶血后，其血清外觀與非溶血標本一致；1％紅細胞發(fā)生溶血后，血清清亮，呈櫻紅色，這樣的標本就代表了中度溶血。有人建議用血清Hb濃度來對溶血程度進行判斷。非溶血標本血清游離Hb為4.8±3.2mg/dl,中度溶血血清Hb為43.5±13.9mg/dl。即使輕微的溶血也可能導致相應指標的測定結果偏高(如LDH、ACP、K等)，這樣的標本應盡量避免使用。高脂的影響:高脂血癥所產生的混濁對某些指標測定的影響，同樣取決于所采用的測定方法。一般而言，脂血通過樣品不均一性、水置換、親脂成分的吸收而影響檢驗結果的準確性。肉眼可見的脂血標本可影響總蛋白的測定、電泳及色譜分析等。五、全血或紅細胞的收集及保存

測定全血或者是紅細胞中相關指標的話，首先需要收集抗凝全血。

全血：收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，可直接定量吸取全血，用冷蒸餾水制備溶血液后用于不同指標的檢測；也可定量吸取全血，轉入EP管，低溫凍存（溫度越低越好），測定之前解凍并按比例加入冷蒸餾水制成溶血液用于檢測。

紅細胞：收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，直接離心吸走血漿，留下層紅細胞，加入3倍體積的生理鹽水，輕輕顛倒混勻，500～1000轉/分,離心5分鐘，棄上清留沉淀紅細胞,重復2～3次,至上清液無色為止（洗滌紅細胞）。

①、直接定量吸取紅細胞，按比例加入冷蒸餾水制成溶血液待測；②、定量吸取紅細胞，轉入EP管，立即低溫凍存（溫度越低越好），測定之前解凍，并按比例加入冷蒸餾水制成溶血液用于檢測(解凍后部分紅細胞會破裂,因此樣本冷凍保存之前必須進行定量)。

溶血液的制備：定量吸取紅細胞或者全血，按比例加入冷蒸餾水，充