結題文件修訂

具有激活皮膚成纖維干細胞功能的中藥單體計算機分子模擬篩選及功效研究中山大學中山醫(yī)學院顧懷宇教授神經抗衰老實驗室2015-10-00

報告內容虛擬篩選細胞實驗動物實驗階段總結未來規(guī)劃參考文獻第一章

計算機虛擬篩選定義虛擬篩選（virtualscreening,VS)

即在進行生物活性篩選之前，在計算機上對化合物分子進行預篩選，以降低實際篩選化合物數(shù)目，同時提高先導化合物發(fā)現(xiàn)效率。一、背景介紹篩選的對象化合物數(shù)據(jù)庫虛擬的實際存在的優(yōu)勢不消耗樣品，降低篩選成本考慮化合物分子的藥動學性質和毒性，增加篩選的內涵虛擬篩選技術的分類根據(jù)靶點的結構知識基于靶點結構的虛擬篩選分子對接基于配體相似性的虛擬篩選藥效基團搜尋基于靶點結構的虛擬篩選——分子對接起源：受體-配體的鎖和鑰匙模型

配體受體復合物分子對接篩選常用的軟件DOCK是應用比較廣泛的對接軟件之一，由Kuntz等設計開發(fā)。它能自動模擬配體在受體活性位點的作用情況，并記錄下最佳的相互作用方式。而且該軟件能對配體的三維數(shù)據(jù)庫進行搜索，因此被廣泛用于基于受體結構的對接篩選。AUTODOCK也是常用的分子對接軟件包之一，由Scripps的Olson科研小組開發(fā)。它采用模擬退火和遺傳算法尋找受體和配體最佳的結合位置，用半經驗的結合自由能方法來評價兩者之間的匹配情況。為了加快計算速度，AUTODOCK采用了格點對接的方法，格點上保存的是探針原子和受體之間的相互作用能，包括了范德華相互作用能、靜電作用能和氫鍵相互作用能等。除此之外，還有一些常用的對接篩選程序，比如FlexX、GOLD、Affinity、Glide等，它們都各自開發(fā)出一套相應的對接篩選策略、打分函數(shù)，使得對接篩選的應用越來越廣泛。EGFREGFR是一種廣泛存在的糖蛋白EGFR能促進表皮組織內多種細胞的生長分裂EGFR的激活可促進細胞新生，抗衰老找到一種調控的藥物胞外域跨膜域胞內域EGFR的變構EGFR的工作機制13

14

EGFR可以啟動兩條主要通路，這兩條通路最終都產生能夠直接作用于細胞核內染色質的轉錄因子，調控細胞周期從而控制細胞的增殖1、Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK通路：

ERK作用于其底物（轉錄調節(jié)因子），磷酸化下游的Elk-1,ATF,NF-κB,Ap-1,c-fos和c-Jun，調節(jié)基因表達和細胞周期，具有促進細胞增殖的作用。其下游的信號通路仍未被完全闡明。152、PI3K-PKB-Akt(PKB)通路：

PKB是原癌基因AKT的產物，此通路與細胞的增殖相關。具體通路也未被完全闡明。以上通路都可以調節(jié)細胞的增殖與再生，因此，適當激活EGFR時，便可促進干細胞的增殖。二、項目分子模擬技術詳情EGFR的胞外結構域與EGF結合的復合體161、明確模擬對象：

待計算配體以及EGFR蛋白結構，所有EGFR蛋白結構來自于蛋白質數(shù)據(jù)庫，主要為解析度為2.8?的EGFR胞外域晶體結構，以及解析度為3.3?的結合了EGF的變構后的EGFR胞外域晶體結構。17本實驗構建EGFR分子模型：正視圖（左）和俯視圖（右）2、制定模擬方案：

首先，我們使用軟件SYBYL1.1修飾獲得的PDB文件，刪除冗余分子以及無關基團，以獲得純凈的蛋白質晶體結構。19

其次，我們使用軟件Autodock4.0設置空間坐標，通過拉馬克遺傳算法（Lamarckiangeneticalgorithm），規(guī)定藥物分子的結合位點，一般而言，我們選定的活性位點即是配體（此處即為EGF）的結合位點。此時初始設置完畢。

正式模擬計算階段，我們使用Autodock中的AutoGrid模塊，計算配體和受體之間的結合自由能。此時為初步篩選，已經可以獲得一部分分子與EGFR的親和信息。20再次，我們使用AMBER11模擬套件進行分子動力學的模擬和數(shù)據(jù)分析。我們在EGFR的模擬中采用的力場是AMBERff03，這一力場對蛋白質二級結構的α-螺旋和β-折疊的受力施力分配較為均衡，因此更適合于EGFR的模擬。我們采用的模擬環(huán)境是TIP3P水盒子，即水環(huán)境，由于人體中主要成分是水，因此我們認為水環(huán)境下進行的模擬更有說服力。21

之后，我們進行配體的調整。我們首先使用Gaussian03程序進行配體分子的幾何結構最優(yōu)化，從而獲得最穩(wěn)定的靜電勢能。并且使用AMBERGAFF程序規(guī)定配體的其余力場參數(shù)，最后使用AMBER11軟件的antechamber套件設定配體缺失的力場參數(shù)。至此分子模擬準備完畢。23

最終，我們可以計算出EGFR和配體的結合自由能，從而可以對配體激活EGFR的能力作出一個計算機評價。

以上模擬計算使用了搭載了192AMDOpteron處理器組的超級計算機。24三、計算結果1、中草藥庫部分

通過分子模擬，我們暫時從34441種中草藥單體庫中篩選出了6個可以與EGFR結合形成良好構象，并且在結合自由能評分中獲得較高分數(shù)的中草藥單體。其主要來自于肉蓯蓉、三七、光甘草定。經過比對2007年化妝品衛(wèi)生規(guī)范，以下中草藥單體均符合化妝品衛(wèi)生要求。兩次得分：-11.3；-11.2三七皂甙Rd人參皂苷Rg127C48H82O18計算機模擬結合自由能得分值名稱分子式C42H72O14兩次得分：-11.3；-10.8兩次得分：-8.5；-8.3人參皂苷Rb1C54H92O23兩次得分：-11.2；-10.9三七皂苷R1肉蓯蓉甙A28C47H80O18計算機模擬結合自由能得分值名稱分子式C36H48O20兩次得分：-11.5；-10.7兩次得分：-8.5、-8.3光甘草定C20H20O42、短肽庫部分

經過對短肽庫的篩選，我們從4392種短肽中篩選出四種符合條件的短肽。它們分別為：

Arg-Arg-Tyr(RRY，精氨酸-精氨酸-酪氨酸)；

Arg-Phe-Trp（RFW，精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸）；

Trp-Arg-Tyr（WRY，色氨酸-精氨酸-酪氨酸）；

Arg-Trp-Tyr（RWY，精氨酸-色氨酸-酪氨酸）。29兩次得分：-9.5；-9.7精氨酸-精氨酸-酪氨酸30計算機模擬結合自由能得分值名稱分子式兩次得分：-9.6；-9.5精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸兩次得分：-9.4；-9.5精氨酸-色氨酸-酪氨酸31計算機模擬結合自由能得分值名稱分子式兩次得分：-9.3；-9.6色氨酸-精氨酸-酪氨酸32部分EGFR-配體作用3D模型計算機模擬Arg-Arg-Tyr--EGFR作用。結果顯示：兩次模擬得分分別為-9.5、-9.7；結合自由能：?31.2kJ/mol計算機模擬Arg-Trp-Tyr--EGFR作用。結果顯示：兩次模擬得分分別為-9.3、-9.6；結合自由能：?32.6kJ/mol36計算機模擬光甘草定-EGFR作用。結果顯示：兩次模擬得分分別為-8.5、-8.3；結合自由能：-33.7146kJ/mol第二章

細胞實驗392.1、CCK-8法細胞篩選CellCountingKit-8簡稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲臜染料(參考圖1)。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關系。40短肽RRY實驗結果用不同濃度RRY(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)處理HSF細胞，cck-8檢測HSF細胞的增殖，干預第一天，各組細胞增殖效應無顯著差異；干預第三天，與對照組比較，RRY0.1、1、10μM處理組細胞增殖均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。41短肽RWY實驗結果用不同濃度RWY(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)處理HSF細胞，cck-8檢測HSF細胞的增殖，干預第一天，各組細胞增殖效應無顯著差異；干預第三天，與對照組比較，RWY0.1、1、10μM處理組細胞增殖均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。42短肽RFW實驗結果用不同濃度RFW(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)處理HSF細胞，CCK-8法結果顯示：干預第一天，0.001、0.1、1、10、100、500μM濃度RFW組細胞增殖均高于對照組，0.01μM組均低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。干預第三天，0.001、0.01、0.1、1、10、100μM組吸光度值高于對照組，差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05），而500μM組吸光度值低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。同時，各干預組干預1，3天，各孔的吸光度值隨著干預時間的延長而上升。43短肽WRY實驗結果用不同濃度WRY(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)處理HSF細胞，CCK-8法結果顯示：干預第一天，0.001、0.01、0.1、10、100μM濃度WRY組細胞增殖均高于對照組，1、500μM組均低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。干預第三天，0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM組吸光度值低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。44中草藥單體光甘草定實驗結果用不同濃度光甘草定(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)處理HSF細胞，CCK-8法結果顯示：干預第一天，0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM濃度與對照組相比無差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。干預第三天，0.1、1、10μM組細胞增殖均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。綜上，短肽RRY、RWY和光甘草定都能引起HSF增殖。我們在后續(xù)EdU實驗中將繼續(xù)驗證以上三種分子對細胞的增殖效果。462.2、EdU法檢測細胞增殖

EdU（5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷）是種胸腺嘧啶核一種胸腺嘧啶核苷類似物。它也能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復制的DNA分子，通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應檢測DNA復制活性，通過檢測EdU標記便能準確地反映細胞的增殖情況。EdU檢測染料只有通?？贵w大小的1/500，在細胞內很容易擴散，無需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可有效檢測，可有效避免樣品損傷，在細胞和組織水平能更準確地反映細胞增殖等現(xiàn)象。EdU檢測原理示意圖采用EdU法分別定量檢測藥物干預條件下誘導3d后皮膚成纖維細胞的增殖能力，如圖所示。結果顯示：短肽Arg-Arg-Tyr對細胞增殖的促進作用以1μM作用最為明顯。采用EdU法分別定量檢測藥物干預條件下誘導3d后皮膚成纖維細胞的增殖能力，如圖所示。結果顯示：短肽Arg-Trp-Tyr對細胞增殖的促進作用以1μM作用最為明顯。采用EdU法分別定量檢測藥物干預條件下誘導3d后皮膚成纖維細胞的增殖能力，如圖所示。結果顯示：中草藥單體光甘草定對細胞增殖的促進作用以10μM作用最為明顯。512.3、流式細胞測細胞周期細胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因為PI特異性結合于細胞DNA，熒光強度與PI的結合量呈良好的線性關系，根據(jù)這個原理，可測出細胞的DNA含量。用于細胞周期、細胞倍體以及凋亡的檢測。Pi分子結構Pi與DNA分子結合DNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數(shù)量2N4N

G1期為DNA合成前期，是細胞為S期的DNA的合成做準備的階段；S期即DNA合成期，一般處于增殖旺盛階段的細胞在此期細胞比例較高，持續(xù)時間較長；G2期為細胞分裂前期；M期為細胞有絲分裂期。采用流式細胞法分別定量檢測藥物干預條件下誘導3d后皮膚成纖維細胞的增殖能力，如圖所示。結果顯示：短肽Arg-Arg-Tyr對細胞增殖的促進作用以1μM作用最為明顯。采用流式細胞法分別定量檢測藥物干預條件下誘導3d后皮膚成纖維細胞的增殖能力，如圖所示。結果顯示：短肽Arg-Trp-Tyr對細胞增殖的促進作用以1μM作用最為明顯。采用流式細胞法分別定量檢測藥物干預條件下誘導3d后皮膚成纖維細胞的增殖能力，如圖所示。結果顯示：中草藥單體光甘草定對細胞增殖的促進作用以10μM作用最為明顯。結論：本章實驗通過cck-8細胞增殖實驗篩選具有生物活性短肽RRY、RWY和光甘草定；EdU增殖結果與cck-8細胞增殖實驗基本吻合；流式細胞實驗結果顯示短肽RRY、RWY和光甘草定通過激活S期，從而促進細胞增殖。第三章

動物實驗實驗方法皮膚表面肉眼觀察組織形態(tài)學觀察標本采集石蠟包埋切片制作皮膚組織HE染色皮膚組織PCNA免疫組織化學染色鏡檢觀察各組小鼠背部皮膚一般形態(tài)觀察各組小鼠背部皮膚組織形態(tài)學觀察各組小鼠背部皮膚組織免疫組織化學染色結果圖13短肽RRY組PCNA免疫組化染色圖14短肽RWY組PCNA免疫組化染色圖15光甘草定組PCNA免疫組化染色結論：本章實驗通過綜合運用肉眼觀察、HE染色方法、免疫組織化學染色方法，從組織形態(tài)生物學方面的實驗，較全面的驗證了短肽RRY、RWY和光甘草定對SD鼠皮膚的影響。結果顯示短肽RRY、RWY和光甘草定對正常SD鼠皮膚組織無毒副作用，對于皮膚安全可靠。且能增強皮膚組織PCNA的表達，具有一定的修復作用。66第四章階段總結

產生知識產權項本項目截止此階段，預計可申報國家專利申請3項；本項目實驗結束后，預計可撰寫科研論文3篇；建議目前即可開始知識產權申請事宜。67第五章未來規(guī)劃

中草藥的粗提物是包含功能性單體的初級純化產物，因其生產成本較低等特性，適合工業(yè)化大規(guī)模生產。同時，工業(yè)化生產的中草藥粗提物其理化性質較穩(wěn)定，可為功能性單體物質提供穩(wěn)態(tài)的微環(huán)境。因此，功能性分子單體復配中草藥粗提物是未來產業(yè)化研發(fā)的發(fā)展趨勢，是基于生物化學分子調控研究的基礎上，有較高可行性的實踐方案。短肽的合成、同位素標記、體內代謝追蹤。68參考文獻[1]Echinacosideimproveshematopoieticfunctionin5-FU-inducedmyelosuppressionmice,SaisaiWang,GangZheng,ShoushengTian,LijuanShen,YongcholPak,YongShen,JingQian,LifeSciences123(2015)86–92.[2]NF-kBplaysakeyroleinmicrocystin-RR-inducedHeLacellproliferationandapoptosisLiangChen,XinZhang,JunChen,XuezhenZhang,HuihuiFan,c,ShangchunLi,PingXie,Toxicon87(2014)120-130.[3]Down-regulationofFRαInhibitsProliferationandPromotesApoptosisofCervicalCancerCellsinVitro,Li-XiaBai,LingDing,Shi-WenJiang,Hui-JieKang,Chen-FeiGao,ChenChe