東南大學(xué)電子學(xué)院《現(xiàn)代光學(xué)基礎(chǔ)》補(bǔ)充內(nèi)容3顯微鏡

OUTLINE7.1OpticalMicroscopy7.2ConfocalMicroscopy7.3ApplicationsofConfocalMicroscopyinBiomedicine第一頁，共七十三頁。7.1OpticalMicroscopyThreegoals:produceamagnifiedimageofthespecimen,separatethedetailsintheimage,renderthedetailsvisibletothehumaneyeorcamera.Simplesinglelensdevicesthatareoftenhand-held,suchasamagnifyingglass.Multiple-lensdesignswithobjectivesandcondensers(compound)第二頁，共七十三頁。Microscopy:HistorySimpleCompound第三頁，共七十三頁。Microscopy:History第四頁，共七十三頁。Microscopy:History第五頁，共七十三頁。Microscopy:ImportanceBiomedicalsciences:overallmorphologicalfeaturesofspecimens;quantitativetooladvancesinfluorochromestainsandmonoclonalantibodytechniques:explosivegrowthintheuseoffluorescencemicroscopyinbothbiomedicalanalysisandcellbiology.opticalmicroscopemostimportantbiomedicalopticExplosivegrowthinphysicalandmaterialssciences;semiconductorindustry,

observesurfacefeaturesofhigh-techmaterialsandintegratedcircuitsForensicscientists:hairs,fibers,clothing,bloodstains,bullets,andotheritemsassociatedwithcrimes第六頁，共七十三頁。SimpleMagnificationSo>>>2fSo>2fSo=2ff<So<2f第七頁，共七十三頁。ImageformationonRetinado~25cm第八頁，共七十三頁。CombinationofLensandEyeSimplemicroscope:bi-convexlens,imageperceivedbyeyeasifitwereatadistanceof10inchesor25centimeters(nearpoint)Imageappearsonsamesideoflensasobject,cannotbeprojectedontoascreen:virtualimage(upright,notinverted).Lightreflectedfromtheroseentersthelensinstraightlines,refractedandfocusedbythelenstoproduceavirtualimageontheretina.Imageoftherosemagnified:perceiveactualsizeofobjecttobeatinfinity;eyestracelightraysbackinstraightlinestovirtualimage

第九頁，共七十三頁。CombinationofLensandEyeSofSilLMP=doDatl=f;DecreaselorL,increaseMP:MP=doD+1atl=0;L=doIncreaselorL,decreaseMP(D=1/f);do=nearpt~25cm第十頁，共七十三頁。CompoundMicroscopeLensclosesttotheobject:objective.Lightfromcondenser,formslightconeconcentratedontotheobject(specimen).Lightpassesthroughthespecimenandintotheobjectiveprojectsareal,inverted,andmagnifiedimageofthespecimentoafixedplanewithinthemicroscope:intermediateimageplane第十一頁，共七十三頁。CompoundMicroscopeLfofeEyeorcameraMP=M(obj)M(e)=(-L/fo)(254/fe)第十二頁，共七十三頁。Airydisksandresolution.(a-c)Airydisksizeandrelatedintensityprofile(pointspreadfunction)asrelatedtoobjectivenumericalaperture,whichdecreasesfrom(a)to(c)asnumericalapertureincreases.(e)TwoAirydiskssoclosetogetherthattheircentralspotsoverlap.(d)Airydisksatthelimitofresolution.Airydisk第十三頁，共七十三頁。Resolutionr=1.2/2NA第十四頁，共七十三頁。7.2ConfocalMicroscopy第十五頁，共七十三頁。PrincipleofConfocalMicroscopy

第十六頁，共七十三頁。第十七頁，共七十三頁。第十八頁，共七十三頁。第十九頁，共七十三頁。PrincipleofCMThekeytechniquetoconfocalmicroscopy

SpatialFilteringTechniquesAdvantages(overconventionalwidefieldopticalmicroscopy)ControldepthoffieldEliminationorreductionofbackgroundinformationawayfromthefocalplaneCapabilitytocollectserialopticalsectionsfromthickspecimens第二十頁，共七十三頁。第二十一頁，共七十三頁。HumanMedullaRabbitsunflowerMuscleFiberspollengrain第二十二頁，共七十三頁。第二十三頁，共七十三頁。第二十四頁，共七十三頁。LasersThefarfieldbeginsatadistance,z,definedby(A(0)isthebeamdiameterattheexitapertureandlisthelaserwavelength)z=A02/l

第二十五頁，共七十三頁。Wavelength(nm)BeamDiameter(mm)FarFieldDistance(cm)Argon-Ion4880.6745141.0195Helium-Neon5430.4305940.7836120.7806320.778Nd:YAG3553.025355321.0188Ti:Sapphire7902.05063952.010127900.881第二十六頁，共七十三頁。Pinhole第二十七頁，共七十三頁。ScanningSystem第二十八頁，共七十三頁。Detectors第二十九頁，共七十三頁。ResolutionandContrastResponseofAOpticalSystemPointSpreadFunction(PSF)Thepropertiesoftheintensitypointspreadfunctionintheimageplaneaswellasintheaxialdirectionaremajorfactorsindeterminingtheresolutionofamicroscope.IntensitypointspreadfunctionextendsinallthreedimensionsLateralcomponentsoftheintensitydistribution:Airydisk.第三十頁，共七十三頁。ResolutionandContrast第三十一頁，共七十三頁。ResolutionandContrastOrderZeroCross-ingsPeaksI13.810027.01.7310.20.4413.30.2第三十二頁，共七十三頁。ResolutionandContrast第三十三頁，共七十三頁。ResolutionandContrastInWidefieldMicroscopeRayleighcriterion

forresolutionstatesthattwopointsareresolvedwhenthefirstminimum(zerocrossing)ofoneAirydiskisalignedwiththecentralmaximumofthesecondAirydisk.Thecontrastvalueis26.4percentrlateral=0.6l/NA

第三十四頁，共七十三頁。ResolutionandContrastInconfocalconfigurations

PointwiseIlluminationScanning+PointwiseDetection

PSFconf.=PSFillum.*PSFdetc.~70%*PSFwidefieldTherefore,

rlateral=0.4l/NA

第三十五頁，共七十三頁。ResolutionandContrastAxialResolutionWidefieldMicroscope:Noopticalsectioningcapability(a)ConfocalMicroscope:

Opticalsectioningcapability(b)第三十六頁，共七十三頁。BenefitsofConfocalMicroscopyReducedblurringoftheimagefromlightscatteringIncreasedeffectiveresolutionImprovedsignaltonoiseratioZ-axisscanning,DepthperceptioninZ-sectionedimagesMagnificationcanbeadjustedelectronically第三十七頁，共七十三頁。DrawbacksofConfocalMicroscopySloweracquisition-needtocollectonepixelatatimeIncreasedphotodamage(photobleaching)duetolongerexposuretoexcitinglight第三十八頁，共七十三頁。HistoricalPerspective

ThebasicconceptofconfocalmicroscopyMarvinMinskyinthemid-1950s(patentedin1957)

M.DavidEggerandMojmirPetranmultiple-beamconfocalmicroscopeinthelate1960s

M.DavidEggerThefirstmechanicallyscannedconfocallasermicroscopeThefirstrecognizableimagesofcellsin1973.Thelate1970sandthe1980s

Growinginterestinconfocalmicroscopy.第三十九頁，共七十三頁。HistoricalPerspectiveApplicationInstrumentsG.FredBrakenhoffdevelopedascanningconfocalmicroscopein1979whilealmostsimultaneously,ColinSheppardcontributedtothetechniquewithatheoryofimageformation.TonyWilson,BradAmos,andJohnWhitenurturedtheconceptandlater(duringthelate1980s)demonstratedtheutilityofconfocalimagingintheexaminationoffluorescentbiologicalspecimens.Thefirstcommercialinstrumentsappearedin1987.Duringthe1990s,thenumberofapplicationsthatcouldbetargetedwithlaserscanningconfocalmicroscopy.第四十頁，共七十三頁。Modernconfocalmicroscopes

Integratedelectronicsystemswheretheopticalmicroscopeplaysacentralroleinaconfigurationoneormoreelectronicdetectors,acomputer(forimagedisplay,processing,output,andstorage)severallasersystemscombinedwithwavelengthselectiondevicesabeamscanningassembly.第四十一頁，共七十三頁。ModernconfocalmicroscopesAentireconfocalmicroscopeisoftencollectivelyreferredtoasadigitalorvideoimagingsystemcapableofpro-ducingelectronicimages.Employedforroutineinvestigationsonmolecules,cells,andlivingtissuesnow第四十二頁，共七十三頁。第四十三頁，共七十三頁。7.3ApplicationsinBiomedicine第四十四頁，共七十三頁。熒光探針（Fluorescentprobe）

WhyneedFluorescentprobe?Stainsinfixedtissuesandlivingcells

Labelingantibodieswithfluorescentdyes－Immunofluorescence

Dyes,QuantumDots,….第四十五頁，共七十三頁。FluorescenceExcitationandEmissionFundamentals

Luminescence

Photolumine-scence

FluorescencePhosphorescence

單光子激發(fā)熒光第四十六頁，共七十三頁。TimescaleRangeforFluorescenceProcessesTransitionProcessRateConstantTimescale

(Seconds)S(0)=>S(1)orS(n)Absorption(Excitation)Instantaneous10-15S(n)=>S(1)InternalConversionk(ic)10-14

to10-10S(1)=>S(1)VibrationalRelaxationk(vr)10-12

to10-10S(1)=>S(0)Fluorescencek(f)orG10-9

to10-7S(1)=>T(1)IntersystemCrossingk(pT)10-10

to10-8S(1)=>S(0)Non-RadiativeRelaxation

Quenchingk(nr),k(q)10-7

to10-5T(1)=>S(0)Phosphorescencek(p)10-3

to100T(1)=>S(0)Non-RadiativeRelaxation

Quenchingk(nr),k(qT)10-3

to100第四十七頁，共七十三頁。StokesShiftandMirrorImageRule第四十八頁，共七十三頁。WhatisTPA?S1S0S10S1vS1S0S10S1vVirtualStateProcessofTwo-PhotonAbsorption雙光子吸收（TPA）與雙光子激發(fā)熒光第四十九頁，共七十三頁。ApplicationsofTPAOpticalpowerlimitingFluorescenceImagingPhotodynamiccancertherapy

Microfabrication3Dopticaldatastorage第五十頁，共七十三頁。雙光子熒光成像（續(xù)）

Hela細(xì)胞的雙光子熒光像。染料為trans-4-[p-(9-ethylcarbazde)vinyl]-N-methypyrid-iniumIodide

第五十一頁，共七十三頁。量子點

又稱半導(dǎo)體納米微晶粒，直徑在1－100nm之間，能夠吸收激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒

量子點熒光材料準(zhǔn)零維尺度人造原子第五十二頁，共七十三頁。量子點的結(jié)構(gòu)（續(xù)）

CoreShellsCoatingPlay第五十三頁，共七十三頁。量子點的性質(zhì)與其它發(fā)光材料最大的區(qū)別：一種材料發(fā)多色光1）在發(fā)光范圍內(nèi)為目標(biāo)光可連續(xù)可調(diào)2）通過調(diào)節(jié)量子點大小對發(fā)光譜調(diào)制Play第五十四頁，共七十三頁。我們制備的不同尺寸的CdSe量子點在同一激發(fā)波長（365nm）下發(fā)出的熒光。

實驗結(jié)果第五十五頁，共七十三頁。樣品（上圖左起2、4、6）的紫外吸收光譜以及相應(yīng)的熒光發(fā)射光譜（PL）樣品2、4、6的熒光峰值和FWHM分別為：544.8nm、581.5nm、609.8nm和20.2、17.4、21.9實驗結(jié)果第五十六頁，共七十三頁。ApplicationsLSCM的高靈敏度、高分辨率、高放大倍數(shù)，提供了光學(xué)顯微鏡無法顯示的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞生物學(xué)研究上了一個臺階。目前我們可以在亞細(xì)胞水平進(jìn)行動態(tài)實驗，檢測細(xì)胞生物質(zhì)和離子通道的變化，觀察細(xì)胞在生理、病理和藥理情況下對外界因素作用所產(chǎn)生的快速反應(yīng)，進(jìn)行定性、定量、定時和定位的分析測量。最常用的功能是細(xì)胞三維重建，細(xì)胞熒光檢測和細(xì)胞顯微操作等

第五十七頁，共七十三頁。細(xì)胞的三維重建（3-DReconstruction）LSCM能以0.1μm的步距沿軸向?qū)?xì)胞進(jìn)行分層掃描，得到一組光學(xué)切片。通過計算機(jī)進(jìn)行不同的三維重建算法，可作單色或雙色圖象處理，組合成細(xì)胞真實的三維結(jié)構(gòu)。旋轉(zhuǎn)不同角度可觀察各側(cè)面的表面形態(tài)，也可不同的斷面觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測量細(xì)胞的長寬高、體積和斷層面積等形態(tài)學(xué)參數(shù)。通過角度旋轉(zhuǎn)和細(xì)胞位置變化可產(chǎn)生三維動畫效果。第五十八頁，共七十三頁。第五十九頁，共七十三頁。第六十頁，共七十三頁。第六十一頁，共七十三頁。細(xì)胞定量熒光測定LSCM以激光為光源，對細(xì)胞分層掃描，單獨測定，經(jīng)積分后能得到細(xì)胞熒光的準(zhǔn)確定量，重復(fù)性極佳。它適于活細(xì)胞的定量分析。適用于快速高靈敏度測量，減少光粹滅的影響，在定量免疫熒光測定方面應(yīng)用廣泛，如作各種腫瘤組織切片抗原表達(dá)的定量分析，監(jiān)測腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的定位定量信息，監(jiān)測藥物對肌體免疫功能的作用等。細(xì)胞定量熒光測定可選用單熒光。雙熒光和三熒光方式，能自動測定細(xì)胞面積，平均熒光強(qiáng)度，積分熒光強(qiáng)度及形狀因子等多種參數(shù)。

第六十二頁，共七十三頁。細(xì)胞內(nèi)鈣離子PH值和其它離子的動態(tài)分析通過Indo－1、Fluo－2、Fluo－3、Calciumgreen、SNARF等多種熒光探針，可對細(xì)胞內(nèi)鈣離子、鈉離子及PH值等作熒光標(biāo)記并對它們進(jìn)行比率值和濃度梯度變化測定。由于細(xì)胞內(nèi)鈣離子為傳遞信息的第二信使，對細(xì)胞生長分化起著重要作用，通過對細(xì)胞內(nèi)鈣離子和其它離子的熒光強(qiáng)度和分布精確測定，測定樣品達(dá)到毫秒級的快速變化。借助光學(xué)切片功能可以測量樣品深層的熒光分布以及細(xì)胞光學(xué)切片的生物化學(xué)特性的變化。第六十三頁，共七十三頁。細(xì)胞胞間通訊（CellCommunication）和膜的流動性動物和植物細(xì)胞中縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊在細(xì)胞增殖和分化中起著重要作用。通過測量細(xì)胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移，可以研究腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊的抑制作用及細(xì)胞內(nèi)鈣離子、pH值等對縫隙連接作用的影響，并監(jiān)測環(huán)境毒素和藥物在細(xì)胞增殖和分化中所起到的作用。細(xì)胞膜熒光探針受到極化光線激發(fā)后，發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，這種有序的運動自由度取決于熒光分子周圍的膜流動性，所以極性測量能間接反映細(xì)胞膜的流動性。

第六十四頁，共七十三