漆酶的固定化,實驗方案

樹脂是工業(yè)中使用得比較廣泛的材料，它價格低廉、機械強度好、物化性能穩(wěn)定、容易再生，用作固定化酶的載體將會有很好的發(fā)展前景。離子交換樹脂是一類不溶也不熔且具有三維空間網(wǎng)狀骨架結構親水性的功能高分子。連接在樹脂骨架上的功能基，可通過吸附、共價鍵、離子鍵、配位鍵、交聯(lián)、微膠囊等形式以及其他手段將酶固定在樹脂上，構成固定化酶［65］。樹脂D380是一種淺黃色球形大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂，在其苯乙烯-二乙烯苯骨架上帶有伯胺基，屬于反應性高分子材料。該樹脂表面的功能基團-NH2,可以和戊二醛一端的醛基反應生成西弗(Schiff)堿，而戊二醛的另一個醛基可以連接酶蛋白中游離的-NH2,因此達到固定化酶的目的。2.1實驗部分2.1.1實驗儀器和試劑2.1.1.1.實驗儀器試驗中用到的主要實驗儀器見表2.1。氣浴恒溫振蕩器 THZ-92B型數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-S型電子分析天平 AB204-N型紫外一可見光分光光度計 VIS-7220G循環(huán)水真空泵 SHI-III型2.1.1.2.實驗試劑主要實驗試劑見表2.2。真菌漆酶>20u/mg樹脂D380戊二醛分析純鄰聯(lián)甲苯胺分析純醋酸分析純醋酸鈉分析純碳酸氫二鈉分析純

分析純分析純分析純分析純分析純氫氧化鈉鹽酸2.1.2實驗方法2.1.2.1樹脂D380的預處理取一定量的樹脂，去離子水浸泡24h,然后用5%HCL浸泡12h,洗滌全中性后再用2%的Na0H浸泡12h,再次洗滌全中性，最后以去離子水浸泡備用。2.1.2.2漆酶的固定化首先，采用兩種方法路線固定化漆酶：先用戊二醛交聯(lián)載體后再吸附漆酶和先用載體吸附漆酶后再用戊二醛交聯(lián)，分別測定兩種方法固定化漆酶的活力，流程見圖2.1所示。其中戊二醛濃度為2%(V:V)，加入量為20mL，緩沖溶液為5mLpH為5.5的醋酸緩沖溶液，酶液為10mL濃度1mg/mL的稀釋酶液。實驗結果表明前者效果明顯優(yōu)于后者，因此后續(xù)實驗均采用此法進行。漆酶的固定化方法:取適量預處理過的樹脂，抽濾去除表面水分，稱取1g置于50ml圓底燒瓶中，加入20ml0.7%(V:V)的戊二醛，在4°C下攪拌反應2h后靜置過夜，再用蒸餾水洗滌多次(至少5次)，去掉未交聯(lián)的戊二醛，然后加入5mlpH為4的醋酸一醋酸鈉緩沖液和2mL稀釋酶液在振蕩器中在25C振蕩反應6h，反應后放在冰箱于4C下靜置一夜，洗滌多次(至少5次)去除未固定化的漆酶，并測定固定化漆酶酶活。

圖2.1兩種固定化方法的流程圖2.1.2.3漆酶活性的測定根據(jù)實驗條件，本文以鄰聯(lián)甲苯胺做底物，采用紫外分光光度法測定該真菌漆酶的酶活力。自由漆酶活力的測定方法【72】：按照表2.3所示，加入各試劑于比色管中，在25^的恒溫水浴中保溫30min,以煮沸滅活的方式終止反應，在VIS-7220G型紫外一可見分光光度計上按表1所示波長測定吸光度值。定義每分鐘引起0.0l吸光度值變化所需的酶量為一個酶活力單位(U/mg)。同時做3個平行樣，一個空白樣(0.1ml酶液換為蒸餾水),結果計算取平均值。表2.3.漆酶活力測定底物緩沖液漆酶用量測定波長0.5ml3.36mM鄰聯(lián)甲苯胺3.4ml0.1M,pH4.6醋酸-醋酸鈉溶液0.1ml0.1mg/ml漆酶溶液600nm固定化酶活的測定：稱取50mg固定化漆酶于比色管中，加入表2.3中的底物和緩沖液，在氣浴恒溫振蕩器中25°C下振蕩30min,取上清液測其在600nm處的吸光度值，計算每克載體的酶活(u/g)。同樣做3個平行樣，一個空白樣，結果取平均值。固定化漆酶的酶活活回收率按照下式計算：酶活回收率(％)二固定化漆酶的總酶活/所用自由漆酶的總酶活2.1.2.4漆酶的米氏常數(shù)Km的測定按照測定自由酶和固定化酶的方法，配制不同濃度的底物，反應后測定吸光度值A，以吸光度值的倒數(shù)1/A代表其反應速度的倒數(shù)1/V作為縱坐標，以底物鄰聯(lián)甲苯胺的濃度倒數(shù)1/S為橫坐標，作圖以求出自由漆酶和固定化漆酶的Km值。2.2.2漆酶固定化條件優(yōu)化酶的固定化率受固定過程中各個因素的影響比較大，如交聯(lián)劑用量、交聯(lián)反應時間、酶用量、酶吸附時間、吸附溫度、pH值等。對這些因素進行優(yōu)化研究，以得到固定漆酶的最佳條件。2.2.2.1戊二醛濃度對固定化漆酶的影響按照2.1.2.2的固定化方法，選擇戊二醛的濃度為0.1%、0.3%、0.5%、O.7%、0.9%和1%(v:v)，交聯(lián)反應4出加入pH=5.5的醋酸一醋酸鈉緩沖溶液和5mL酶液，振蕩反應6h。將結果畫成折線圖戊二醛是交聯(lián)劑，能夠與載體和漆酶的氨基發(fā)生反應生成西弗(Schiff)堿【30】，隨著濃度的增加，固定在載體上的漆酶是增加的。但是，戊二醛也能使漆酶變性【571,達到一定濃度時，反而使漆酶因失活而回收率下降。2.2.2.2交聯(lián)時間對固定化漆酶的影響戊二醛濃度為0.7%,交聯(lián)時間分別為2、4、6、8、l0和12h,其他條件不變，測定固定化漆酶活力，作圖 酶活回收率下降，可能是由于戊二醛對漆酶的失活作用所致。隨著交聯(lián)時間的延長，固定化漆酶的酶活回收率變化不大，說明戊二醛與載體上氨基的反應已經(jīng)飽和。2.2.2.3漆酶用量對固定化漆酶的影響按照以上的固定化方法，漆酶用量取1、2、3、4、5和6ml。作圖。當給酶量一定時漆酶的游離氨基與載體上游離醛基的反應達到飽和2.2.2.4吸附時間對固定化漆酶的影響當給酶量為2ml，吸附時間分別為2、4、6、8、10、和12h時，測定固定化漆酶的酶活回收率。作圖。 隨著時間增加，酶活回收率先增加后降低，在最高點時吸附達到飽和，再增加吸附時間，由于振蕩會使吸附在載體上未反應的漆酶掉落，酶活回收率降低。2.2.2.5溫度對固定化漆酶的影響按照以上的固定化方法，設定吸附溫度為15、20、25、30、35和40°C，測定漆酶活力，作圖。2.2.2.6pH值對固定化漆酶的影響吸附溫度設為25C，加入緩沖液的pH分別為3、3.5、4、4.5、5、5.5和6時，觀察固定化酶的酶活回收率變化，作圖。2.2.3.紅外分析樹脂D380是一種淺黃色球形大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂，在其苯乙烯-二乙烯苯骨架上帶有伯胺基，屬于反應性高分子材料。該樹脂表面的功能基團-NH2,可以和戊二醛一端的醛基反應生成西弗（Schiff）堿，而戊二醛的另一個醛基可以連接酶蛋白中游離的-NH2,因此達到固定化酶的目的。將戊二醛交聯(lián)后和固定化漆酶后的載體做紅外光譜檢測圖中3400cm處的強峰為-OH和-NH2的伸縮振動峰，2920cm附近的吸收峰均為C-H的伸縮振動峰2.2.4.1固定化漆酶的最適溫度在不同的溫度下測定固定化漆酶的活力，如圖2.10所示，15?20°C為固定化漆酶的最適溫度范圍，30C以后酶活力損失較大，說明該形式的漆酶在過高的溫度下容易失活。相對于自由漆酶的最適溫度30C，固定化漆酶的最適溫度有所下降。2.2.4.2固定化漆酶的最適pH在不同的pH（3—6為CH3COOH-CH3COONa溶液，7—8為NaH2P04-Na2HP04溶液）下測定固定化漆酶的活力，如圖2.11所示，可見該固定化漆酶的最適pH為4，比較適合酸性環(huán)境，當pH大于5時，酶活力損失較大。2.2.4.3兩種形式漆酶的儲存穩(wěn)定性比較將自由漆酶和固定化漆酶在4C下存放兩周，定期分別測定其酶活力，結果見圖2.12。由圖可見，固定化漆酶的儲存穩(wěn)定性較好，在兩周后還有約80%的相對酶活，而自由漆酶僅為50%。由此可見，固定化漆酶的儲存穩(wěn)定性大大提高。2.2.4.4兩種形式漆酶的米氏常數(shù)Km按照測定自由酶和固定化酶的方法配置不同濃度的鄰甲聯(lián)苯胺（0.1、0.2、03、0.4和0.5mmol/L）作為底物測定反應后的吸光度值A，以吸光度值的倒數(shù)1/A代表其反應速度的倒數(shù)1/V作為縱坐標，以底物鄰聯(lián)甲苯胺的濃度倒數(shù)1/S為橫坐標，依照Lineweaver一Burk圖解法求出自由漆酶和固定化漆酶的Km值。2.3本章小結樹脂的諸多優(yōu)點使其成為工業(yè)上廣泛使用的材料。用離子交換樹脂D380已經(jīng)成功地固定了胰蛋白酶【75】和果膠酶‘651，而用其固定漆酶尚未見報道。本章以樹脂D380為載體，戊二醛為交聯(lián)劑固定化漆酶，得到最佳固定化條件為：戊二醛濃度0.7%,交聯(lián)時間2h,加酶量2mL,吸附時間6h,固定化溫度25°C,pH為4,最終得到的酶活回收率為65.94%。在最佳條件下得到的固定化漆酶的最適溫度為20C,最適pH為4,在4C下保存兩星期仍保持約80%的酶活，而自由漆酶僅為