胡蘿卜肉質(zhì)根愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代增值培養(yǎng)實驗報告

綜合性實驗報告胡蘿卜肉質(zhì)根愈傷組織誘導(dǎo)及繼代增殖培養(yǎng)一、實驗原理及目的（一）實驗?zāi)康?、通過MS□□□□□□□□□□□,□□□□□□□□□□□□□□□□能。2、通過MS□□□□□□□□,□□□□□□□□□□□□□3、學(xué)會和掌握誘導(dǎo)愈傷組織的基本技術(shù)。4、初步掌握組織培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。5、初步掌握外植體的消毒技術(shù)。6、掌握組培室常用的化學(xué)試劑。7、學(xué)會和掌握愈傷組織繼代培養(yǎng)的基本操作技術(shù)。（二）實驗原理分別先配制成一1、配制培養(yǎng)基時，為了使用方便和用量準確，通常采用母液法進行配制，即將所選培養(yǎng)基配方中各試劑的用量，擴大若干倍后再準確稱量，分別先配制成一系列母液置于冰箱中保存，使用時按比例吸取母液進行稀釋配制即可。2、在自然情況下，根主要為植物吸收和固定的重要器官，同時，有些植物的根亦具有繁殖的功能。植物根生長快、代謝能力強、變異小，使得其在研究根的營養(yǎng)吸收、生長和代謝的變化規(guī)律、理論與實踐意義。器官分化、形態(tài)建成規(guī)律等方面具有重大的營養(yǎng)吸收、生長和代謝的變化規(guī)律、理論與實踐意義。器官分化、形態(tài)建成規(guī)律等方面具有重大的依據(jù)細胞全能性原理，即指任何具有完整細胞核的細胞（動物、植物等）都擁有形成一個完整個體所必需的全部遺傳信息質(zhì)根細胞同樣具有形成完整再生植株的能力。養(yǎng)而保存的，在遺傳上具有一致的根的培養(yǎng)物，體根的無性系可以進行器官再生體系、究。3、愈傷組織（□DNA）都擁有形成一個完整個體所必需的全部遺傳信息質(zhì)根細胞同樣具有形成完整再生植株的能力。養(yǎng)而保存的，在遺傳上具有一致的根的培養(yǎng)物，體根的無性系可以進行器官再生體系、究。3、愈傷組織（這種由單個根衍生而來并經(jīng)繼代培稱為離體根無性系。利用這些離苗木無性系快速繁殖和其他方面的實驗研callus）原指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的組織。它由活的薄壁細胞組成，可起源于植物體任何器官內(nèi)各種組織的活細胞。在植物體的創(chuàng)傷部分，愈傷組織可幫助傷口愈合；在嫁接中，可促使砧木于接穗愈合，并由新生的維管組織使砧木與接穗溝通。在植物器官、組織、細胞離體培養(yǎng)時，條件適宜也可以長出愈傷組織。其發(fā)生過程是：外植體的活細胞經(jīng)誘導(dǎo)，恢復(fù)其潛在的全能性，轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚毎?，繼而其衍生的細胞分化為薄壁細胞組織而形成愈傷組織。愈傷組織誘導(dǎo)的成敗關(guān)鍵主要不是外植體的來源種類，而是培養(yǎng)條件，其中激素的種類和濃度最為重要。誘導(dǎo)愈傷組織常用的生長素是2,4-D，IAA和

KT和6-BA。KT和6-BA。3個時期：，愈PH=5.8左愈傷組織形成的過程分為誘導(dǎo)期、分裂期和分化期(形成期)傷組織的生長是發(fā)生在不與瓊脂培養(yǎng)基接觸的表面。4、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿性至右。由于培養(yǎng)基的PH值直接影響到培養(yǎng)物對離子的吸收，因而過酸或過堿都會對植物材料的生長有很大的影響。此外，PH還影響到瓊脂培養(yǎng)基的凝固情況。所以，當培養(yǎng)基配制好后應(yīng)立即進行PHO調(diào)整。培養(yǎng)基若偏酸時用氫氧化鈉(1mol/L)來調(diào)節(jié)，若過堿就用鹽酸(1mol/L來調(diào)節(jié)。當PH值高于6.0時，培養(yǎng)基將會變硬；當PH值低于5.0時，瓊脂不能很好地凝固。5、植物組織培養(yǎng)的優(yōu)點：①研究材料來源單一，無性系遺傳背景一致；口經(jīng)濟口方便口效率高；③條件可口口誤差小;④生長快口周期短口重復(fù)性強;⑤可全年試驗或生長。6、繼代培養(yǎng)是指愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間后，營養(yǎng)枯竭，水分散失，并已經(jīng)積累了一些代謝產(chǎn)物，此時需要將這些組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這種轉(zhuǎn)移稱為繼代培養(yǎng)。實際上就是對來自于外植體所增殖的培養(yǎng)物（包括細胞、組織或其切段）通過更換新鮮培養(yǎng)基及不斷切割或分立，進行連續(xù)多代的培養(yǎng)。將誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽、苗、愈傷組織、原球莖或胚狀體等培養(yǎng)物重新分割，接種到新鮮培養(yǎng)基上進一步擴大培養(yǎng)的過程稱為繼代培養(yǎng)，也稱為增殖培養(yǎng)。該過程是植物組織培養(yǎng)中決定繁殖速度快慢、繁殖系數(shù)高低的關(guān)鍵階段。繼代使用的培養(yǎng)基對于一種植物來說，每次幾乎完全相同。由于培養(yǎng)物在適宜的環(huán)境條件、充足的營養(yǎng)供應(yīng)和生長調(diào)節(jié)劑作用下，排除了其他生物的競爭，繁殖速度大大加快。二、實驗所需儀器設(shè)備及其原理（一）冰箱用于長期貯存培養(yǎng)基母液、生化試劑及低溫處理材料。（二）培養(yǎng)箱用于少量植物材料的培養(yǎng)。有條件的話，還可采用全自動的調(diào)溫、調(diào)濕人工氣候箱來進行植物組織培養(yǎng)和試管苗快繁。（三）超凈工作臺超凈工作臺是為植物組織培養(yǎng)提供無菌操作環(huán)境，是最常用、最普及的無菌操作裝置，和無菌室相比，超凈工作臺既方便又舒適，無菌效果又好。超凈工作臺一般由鼓風(fēng)機、過濾器、操作臺、紫外燈和照明燈等部分組成。它是將空氣過濾后形成無菌的風(fēng)，創(chuàng)造出一個無菌環(huán)境。根據(jù)風(fēng)幕形成的方式，超凈工作臺可分為水平式和垂直式兩種。在一般的植物組織培養(yǎng)中，兩種都可以采用，而進行植物的遺傳轉(zhuǎn)化操作和農(nóng)桿菌、大腸桿菌的接種時，最好采用垂直風(fēng)幕式的超凈工作臺，這樣可以避免細菌在空氣中的擴散。（四）高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋主要用于培養(yǎng)基、蒸餾水和各種器械的滅菌消毒。高壓滅菌鍋有大型、中型和小型三種。實驗室最常用的是中型立式全自動滅菌鍋和小型便攜式美景，大型臥底式高壓滅菌鍋在大型工廠化植物組織培養(yǎng)上使用。（五）天平□□□□□□□□□□1/100g、1/10g）,□□□□□□□□□□□□□□□,需要用分析天平（1/10000g）。（六）蒸餾水制備裝置有蒸餾型和離子交換型兩種。需要時，還可以進行重蒸餾來獲得純度更高的蒸餾水。三、培養(yǎng)基及其機制（一）培養(yǎng)基是供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工培植的養(yǎng)料，一般含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。（二口植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基——MS培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog于1962□□□□□□□□□,□□□□：□機鹽和離子濃度高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細胞的營養(yǎng)和生理需要，因而使用范圍較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基是目前使用最普遍的培養(yǎng)基。其具有較高的無機鹽濃度，能夠保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)，還能加速愈傷組織的生長，由于配方中的離子濃度較高，在配制、貯存和消毒等過程中，即使有些成分略有出入，也不會打破離子

間的平衡。MS固體培養(yǎng)基可用于誘導(dǎo)愈傷組織，也可用于胚、莖段、莖尖及花藥的培養(yǎng)，其液體培養(yǎng)基用于細胞懸浮培養(yǎng)時能獲得明顯的成功。MS培養(yǎng)基的無機養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，足以滿足植物細胞在營養(yǎng)上和生理上的需要。MS培養(yǎng)基中的系哦啊酸鹽、鉀和MS培養(yǎng)基中的系哦啊酸鹽、鉀和.配制MS母液培養(yǎng)基（1）所需儀器電子天平、燒杯、容量瓶、細口瓶、藥勺、玻璃棒、電爐、量筒、稱量紙、PH試紙、冰箱（2）所需藥品NHNO□KNO□CaCl?2H0、MgSO?7H0、KHPO、HBO、MnSO?4H0、ZnSO?7H0、433224224334242NaMoO?2HO、KI、CuSO?5HO、CoCl?6HO、FeSO?7HO、Na-EDTA?2HO、肌醇、口酸、4鹽酸吡哆醇（維生素42B）、鹽酸硫胺素（維生素42B）、2甘氨酸、蒸餾2水.61□□□□□□□□□CaCl?2HO要在最后單獨加入口用量=□□□□□□□□□□□□□□□22n=20v=1L母液化合物規(guī)定量□mg/L）擴大倍數(shù)□□20）□□□□g）培1L培養(yǎng)基所需母□（ml）大量元素母液KNO31900380003850NHNO4316503300033MgSO7HO37074007.4khpO22417034003.4CaClJ2H2O44088008.8□□□□，□□□□，□□□□，□□，□□□□□□，□□□，□□4℃冰箱?！酢酢酢酢酢酢酢酢鮂e□□□□□n=200v=1LMnSO?③鐵鹽母液配制4n=200配500ml螯合態(tài)的鐵，混合煮沸，4Hn=200v=1LMnSO?③鐵鹽母液配制4n=200配500ml螯合態(tài)的鐵，混合煮沸，PH=5.8~6.2（用NaOH溶液調(diào)其PH）④有機物的配制（單一母液）肌醇（10mg/ml配250ml）VB1（1mg/ml配250ml）VB6（1mg/ml配250ml）煙酸（1mg/ml配250ml）甘氨酸（2mg/ml配250ml）⑤生長調(diào)節(jié)物配制6-BA（1mg/ml配100ml）2,4-D（1mg/ml配100ml）NAA（1mg/ml配100ml）mol/LnaOH或注：6-BA先用少量1mol/LHCl溶解，2,4-D和NAAmol/LnaOH或95口酒精溶解。2.配制胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（2.配制胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基）（1）配方：+2mg/LNAA+0.1mg/L6-BA+200mg/L水解酪蛋白+3口蔗糖+0.7+2mg/LNAA+0.1mg/L6-BA+200mg/L水解酪蛋白+3口蔗糖+0.75ml鐵鹽：5ml200mg/L□□□□□：即：大量元素：50ml微量元素：5ml有機物成分：2mg/LNAA：2mg(ml)0.1mg/L6-BA：0.1mg(ml)200mg蔗糖：30g瓊脂：7g注：由于配制減半，因此上述試劑均減半。20瓶，每瓶25ml。2min□□□；20瓶，每瓶25ml。2min□□□；；（3）步驟：□□□□□3.5g+350ml□□□,□□□□□□□□□□□□□□□15g蔗糖）③把CH□□□□□□□□□□；□□□□MS□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□,□□□□□相應(yīng)的容器中；⑤PH調(diào)整為6.0~6.2,并定容到500ml；□□□□□□□□；□□□121口1.1kg/cm2,15min)；⑧保存。3.繼代培養(yǎng)基的配制MS基本培養(yǎng)基+6-BA+NAA+2,4-D+C+CH蔗糖15g；瓊脂3g；大量元素2.5ml；微量元素2.5ml；鐵鹽0.5ml；肌醇5ml；VB0.5ml；VB0.25ml；煙酸0.25ml；甘氨酸0.5ml；CH0.1g。制500ml，分為22瓶,PH為5.8。四、外植體消毒及無菌操作技術(shù)□一)外植體消毒在離體根培養(yǎng)中，首先芽解決外植體消毒問題，因為在自然條件下，根生長在土壤中，要進行徹底滅菌、消毒。為了消滅這種污染源，在把植物組織接種到培養(yǎng)基上之前必須要進行徹底的表面消毒；內(nèi)部已受到真菌或細菌侵染的組織在組織培養(yǎng)研究中一般都淘汰不用。胡蘿卜的肉質(zhì)根，其硬度較大，容易操作，可直接用滅菌劑進行處理?！酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢?□□□□□□□□□□□□；②用70口~75口的酒精浸泡胡蘿卜2min；③放入0.1口HgCl中浸泡10min；④用無菌水洗4次；2□□□：□□□□□□□□□□□□□□□□二)無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù)室用于防止微生物進入實驗室區(qū)內(nèi)的操作技術(shù)。□□：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；□□□□□□□□□□□□□□,□□□□□□□□□目前，多數(shù)實驗室都使用各種類型的超凈工作臺進行無菌操作。步驟：□□□□□30min□□□□□□□□□□□□,□□□□□□□□□□□免紫外燈的照射，做實驗時將紫外燈關(guān)閉?！酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢?0口）□□□□□,□□□□□□□□□□70口的酒精消毒?！酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢?0口的酒精浸泡，之后放在酒精燈上火燒滅菌，再放在滅菌支架上冷卻后使用?！酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢?□□□□□□□□□□□□□□□□□（三）實驗操作的注意事項.進行胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)，首先要在無菌的濾紙上將已消毒的外植體的表面輕輕切去；.移入培養(yǎng)基時，打開封口，封口紙要小心擺正，不能亂丟亂放；.鑷子用手拿住上端，不能去拿下端；.整個操作過程要盡量在超凈工作臺的無菌范圍內(nèi)進行；.禁止操作時正面大聲講話。五、實驗結(jié)果及討論（一）實驗結(jié)果1.胡蘿卜肉質(zhì)根愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果：□□□□□4□□□□□12污染瓶數(shù)1污染口數(shù)3□□□□□3□□□□□9未污染口中愈傷□□□□□□7□□□□□□□77口2.胡蘿卜愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)結(jié)果這次試驗總的接種瓶數(shù)為2瓶，無污染瓶；但是愈傷組織沒有進行進一步的生長，增殖不是很好，呈現(xiàn)暗色。（二）對試驗結(jié)果的分析.胡蘿卜肉質(zhì)根愈傷組織的誘導(dǎo)（1）其中一瓶接種瓶受污染，可能是由于在使用解剖刀切胡蘿卜時，拿鑷子的部位靠下后導(dǎo)致污染了細菌；也可能操作時沒有在超凈工作臺的無菌范圍內(nèi)；也可能由于材料本身內(nèi)部已經(jīng)收到了污染，或是在切離胡蘿卜表面時，沒有徹底將材料表面切干凈，導(dǎo)致接種后受污染；也有可能所使用的工具消毒不夠徹底，或是操作不規(guī)范，如接種掀開培養(yǎng)瓶封口膜時手指碰到了封口膜里面，或是封口膜沒有綁緊，導(dǎo)致了微生物的進入。（2）已接種好的材料，愈傷組織發(fā)生不好的或是沒有發(fā)生的?？赡苁怯捎冢骸酢酢酢酢酢酢?□□□□□□□□□□□□□□□□□；□□□□□□□,□□□□□□□□；□□□□□□□□□□□□□,□□□□□HgCl□□□□□□□□□□愈傷組織化。2.愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)（1）培養(yǎng)瓶沒有被污染，但是愈傷組織僅在培養(yǎng)基上發(fā)育了一段時間后就終止其生長，其原因有：□□□□□□□□□□,□□□□□□□□□□□□□□□□□□;□□□□,□□□□□□□□□□□□□□□□□□（三）實驗討論.調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH□,□□□□□□5.8□□,□□□□□□□□□□□□□□,□□□□□,PH□□□□□□,□□PH值調(diào)至6.0□□□□□□2.植物組織培養(yǎng)實驗中，必須的前提是：無菌操作，胡蘿卜肉質(zhì)根（外植體）經(jīng)HgCl□□□□□□,□□□□□□□□,□□□□□□□,□□□□□□□徹底消毒，操作2過程中動作要規(guī)范實施。.□□□□□□□□,□□□HgCl□□□□□□,□□□□□□□□□□.切胡蘿卜時，下方要墊上無菌濾紙。2.接種時，動作要輕，力度要適中，不要把接種的材料切塊壓入到培養(yǎng)基里面，以致破壞培養(yǎng)基；切塊大小要適中，不宜太大，也不宜太小。.MS培養(yǎng)基的特點：①無機鹽濃度高；□□□□□□□□,□□□□□□；□□□□□□□□□,□□□□；④不需要添加更多的有機附加物。.植物組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件：與自然條件一樣，組織培養(yǎng)中的材料的生長要受到溫度、光照、濕度等各種物理條件，不同氣體、培養(yǎng)基的組成、PH值和滲透壓等各種化