植物原生質(zhì)體融合技術(shù)

微絲葉綠體線粒體質(zhì)膜液泡細胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微管細胞壁高爾基體植物細胞模式圖細胞壁由三種主要成分構(gòu)成纖維素25-50%、半纖維素53%和果膠5%第1頁/共62頁第一頁，共63頁。◆What基本原理◆去除植物細胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體◆誘導原生質(zhì)體融合形成雜種細胞◆篩選，培養(yǎng)，促進雜種細胞分裂，分化◆從細胞團，愈傷組織到最后成株第2頁/共62頁第二頁，共63頁?！鬢hy技術(shù)應(yīng)用植物原生質(zhì)體融合的意義：◆克服種、屬以上植物有性雜交不親和性障礙◆為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細胞創(chuàng)造條件第3頁/共62頁第三頁，共63頁?！鬑ow技術(shù)方法第4頁/共62頁第四頁，共63頁。第16章植物原生質(zhì)體融合技術(shù)PlantProtoplastFusion植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的融合第5頁/共62頁第五頁，共63頁。一、植物原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義原生質(zhì)體材料來源原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的純化第6頁/共62頁第六頁，共63頁。1、原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義概念：除去植物細胞壁的裸露細胞，稱為原生質(zhì)體意義：（1）植物原生質(zhì)體，具有再生完整植株的力。（2）為細胞融合研究提供了可能。有可能產(chǎn)生異源雜交新品種。（3）由于除去了細胞壁，降低了細胞的DNA酶活性，從而有助于外源DNA的進入。為再生成具有新性狀的植物體提供有利條件。（4）是開展遺傳理論研究的材料。第7頁/共62頁第七頁，共63頁。植物原生質(zhì)體在理論研究和細胞工程中的地位信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換細胞壁合成機理膜的結(jié)構(gòu)與功能核質(zhì)關(guān)系雜交或自交不親和的機理細胞間的相互作用植物激素的作用機理融合產(chǎn)生體細胞雜種分離各種細胞器引入各種細胞器導入外源基因誘發(fā)突變體第8頁/共62頁第八頁，共63頁。純化后的葉肉原生質(zhì)體第9頁/共62頁第九頁，共63頁。2、原生質(zhì)體材料來源★植物葉片－取材容易－比較容易用酶解法分離★植物根尖組織－可由各種植物的種子萌發(fā)后取得★植物花粉－產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體★愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細胞－細胞壁容易解離第10頁/共62頁第十頁，共63頁。3、原生質(zhì)體的分離第11頁/共62頁第十一頁，共63頁。A、原生質(zhì)體的分離方法★機械分離法－先將細胞放在高滲溶液中預處理，待細胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原體質(zhì)體收縮成球形式，再用機械法磨碎細胞，從傷口處可以釋放出完整的原生質(zhì)體。－優(yōu)點：該方法可避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用。－缺點：獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少?！锩附夥蛛x法 常用的細胞壁降解酶種類：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、果酸酶等

優(yōu)點：可以獲得大量的原生質(zhì)體，而且?guī)缀跛械闹参锘蛩鼈兊钠鞴俳M織或細胞均可用酶解法獲得原生質(zhì)體。

缺點：酶制劑中均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)。影響所獲原生質(zhì)體的活力。第12頁/共62頁第十二頁，共63頁。B、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素1）不同種類植物或不同組織和細胞，其細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)有差異2）滲透壓穩(wěn)定劑：如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、鹽類（KCl,MgSO4.7H2O)等3）質(zhì)膜穩(wěn)定劑：如葡聚糖硫酸鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀等增加對質(zhì)膜的穩(wěn)定性4）酶液的pH值：一般在5）溫度因子6）植物材料的生理狀態(tài)：如株齡、發(fā)育狀態(tài)、栽培條件等對取材影響很大第13頁/共62頁第十三頁，共63頁。C、分離原生質(zhì)體所用的酶液和穩(wěn)定劑▲煙草葉肉細胞：0.5%MacerozymeR-10果膠酶+2%OnozukaR-10纖維素酶，0.7M甘露醇?！鵁煵輵腋〖毎?/p>

2%Driselase纖維素酶+2%Cellusase纖維素酶+0.5%Macerozyme果膠酶；海水?！}卜懸浮培養(yǎng)的細胞：2%Onozuka纖維素酶+0.5%Driselase纖維素酶+0.5%Rhoxyme半纖維素酶1%Pectinase果膠酶；甘露醇+0.35M山梨醇▲甘藍等的根細胞：4%Maicelase纖維素酶+2%Rhozyme半纖維素酶+0.3%Macerozyme果膠酶；0.7M甘露醇?！褵o菌苗的子葉和葉肉細胞：1.5%Cellulysin纖維素酶+0.3%Macerozyme果膠酶；蔗糖?！痉N子的愈傷組織的懸浮培養(yǎng)細胞：2%OnozukaRs纖維素酶+1%Driselase纖維素酶+2%MacerozymeR-10果膠酶+1%Pectolyase果膠酶；0.3M葡萄糖第14頁/共62頁第十四頁，共63頁。4、原生質(zhì)體的純化去除破碎的原生質(zhì)體、末去壁的細胞、細胞器及其他碎片等雜質(zhì)A、過濾法B、漂浮法C、離心法第15頁/共62頁第十五頁，共63頁。例:煙草葉肉細胞原生質(zhì)體的分離1).材料的準備與消毒：2).酶解：3).純化：4).原生質(zhì)體的活力測定第16頁/共62頁第十六頁，共63頁。1).材料的準備與消毒選取在溫室中生長兩個月左右的煙草植株從生長健康的植株上摘取充分展開的嫩葉片經(jīng)自來水沖洗干凈后放入70%乙醇中進行表面消毒然后再放入2%次氯酸鈉溶液中處理10分鐘接著用無菌水洗滌3～4次，以充分除去消毒劑第17頁/共62頁第十七頁，共63頁。2).酶解

用一把尖鑷子，小心撕去葉片的下表皮，將葉片切成2cm長的小片，然后放入含酶溶液中處理。（注意：使撕去表皮的一面朝下，溫度25～28℃下經(jīng)3-4小時的酶解反應(yīng)，其間輕輕搖動培養(yǎng)皿若干次）第18頁/共62頁第十八頁，共63頁。3).純化

將酶解懸浮液通過300-400目網(wǎng)，以除去大的未消化的碎片 然后將含有原生質(zhì)體的酶液收集在離心管中，低速離心，使原生質(zhì)體沉于管底，傾去上清液 在離心管中加入適量洗滌液，再離心；重復此步驟3次，使酶解液充分除去； 最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液離心一次第19頁/共62頁第十九頁，共63頁。分離、洗滌、純化原生質(zhì)體

的試劑試劑分離洗滌純化KH2PO427.2mgKNO3101mgCaCl2.2H2O1480mgMgSO4.7H2O240mgKI0.16mgCuSO4.5H2甘露醇13%纖維素酶4%果膠酶0.4%蔗糖----21%與分離試劑相同與分離試劑相同第20頁/共62頁第二十頁，共63頁。4).原生質(zhì)體的活力測定

形態(tài)： 把形態(tài)上完整，富含細胞質(zhì)，顏色新鮮的原生質(zhì)體釋放到降低滲透壓濃度的洗滌液或培養(yǎng)基中，即可見到分離后縮小的原生質(zhì)體會恢復原態(tài)，成為正常膨大的一般是有活力的原生質(zhì)體。

染色法： 用0.1%酚藏花紅液染色，活的原生質(zhì)體能著紅色 用熒光素雙醋酸酯（FDA）染色，在熒光顯微鏡下觀察到帶有熒光的是有活力的原生質(zhì)體第21頁/共62頁第二十一頁，共63頁。FDA法的原理FDA本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以自由出入細胞膜。在活細胞中，F(xiàn)DA被酯酶裂解，釋放出有極性的熒光素。熒光素不能自由穿越質(zhì)膜，在活細胞中積累。熒光素在死細胞中不能積累。在UV照射下，活細胞中的熒光素發(fā)出綠色熒光。第22頁/共62頁第二十二頁，共63頁。FDA熒光素活細胞死細胞請思考活細胞死細胞FDA先用丙酮配成0.5%的母液，終濃度為0.01%第23頁/共62頁第二十三頁，共63頁。原生質(zhì)體分離純化流程圖第24頁/共62頁第二十四頁，共63頁。第16章植物原生質(zhì)體融合技術(shù)PlantProtoplastFusion植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的融合第25頁/共62頁第二十五頁，共63頁。二、植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)1、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法2、原生質(zhì)體培養(yǎng)程序3、原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的技術(shù)關(guān)鍵第26頁/共62頁第二十六頁，共63頁。固體培養(yǎng)法 原生質(zhì)體按照一定細胞起始密度，均勻分布于薄層固體培養(yǎng)基中 此法優(yōu)點有利于對單個原生質(zhì)體的胞壁再生和對細胞團形成的全過程進行定點觀察淺層液體培養(yǎng)法：

在培養(yǎng)皿或三角瓶中注入3~4ml原生質(zhì)體培養(yǎng)液，然后將純凈的原生質(zhì)體，按一定的細胞密度注入并進行培養(yǎng)雙層培養(yǎng)法

在固體培養(yǎng)基上，加入適宜原生質(zhì)體胞壁再生和細胞分裂的液體培養(yǎng)基1、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法第27頁/共62頁第二十七頁，共63頁。第28頁/共62頁第二十八頁，共63頁。2、原生質(zhì)體的培養(yǎng)程序

細胞壁再生： 體積膨大，葉綠體重新排列，新的細胞壁開始合成，細胞由球形變成橢圓形。 細胞分裂形成細胞團： 一般在培養(yǎng)2-3天后細胞質(zhì)增加，細胞器增殖，DNA、蛋白質(zhì)等合成增加，細胞分裂，形成小的細胞團，發(fā)育成愈傷組織或胚狀體。 器官形成植株再生： 從愈傷組織誘導發(fā)生 胚狀體發(fā)育第29頁/共62頁第二十九頁，共63頁。3、原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的技術(shù)關(guān)鍵原生質(zhì)體的活力 影響因素：制備原生質(zhì)體的方法，滲透壓穩(wěn)定劑種類、濃度，質(zhì)膜穩(wěn)定劑種類、濃度，溫度和保溫時間原生質(zhì)體密度 起始密度一般為104-105個/mL細胞壁再生速度 植物種類和取材的生理狀態(tài)；培養(yǎng)細胞所處的時期；酶解時所用質(zhì)膜穩(wěn)定劑種類原生質(zhì)體培養(yǎng)的營養(yǎng)和環(huán)境 培養(yǎng)基 原生質(zhì)體培養(yǎng)的環(huán)境：光照、溫度、濕度第30頁/共62頁第三十頁，共63頁。第16章植物原生質(zhì)體融合技術(shù)PlantProtoplastFusion植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的融合第31頁/共62頁第三十一頁，共63頁?；仡櫍簞游锛毎诤霞夹g(shù)簡介◆親本的來源◆融合方法◆融合細胞的篩選◆融合細胞的克隆◆融合細胞的鑒定第32頁/共62頁第三十二頁，共63頁。三、植物原生質(zhì)體的融合1、植物細胞融合的概念和意義2、植物細胞融合的程序3、誘導細胞融合的方法及融合劑4、細胞融合的影響因素5、細胞雜種的選擇和鑒定第33頁/共62頁第三十三頁，共63頁。1、植物細胞融合的概念和意義細胞融合(cellfusion)概念： 又稱細胞雜交(cellhybridizaion)：離體條件下用人工的方法把不同的細胞通過無性方式融合成一個雜合細胞的技術(shù)。細胞融合的意義： 克服種、屬以上植物有性雜交不親和性障礙 為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細胞創(chuàng)造條件第34頁/共62頁第三十四頁，共63頁。2、植物細胞融合的程序◆原生質(zhì)體分離的分離、純化◆融合方法選擇◆雜種細胞的篩選◆愈傷組織形成器官分化植株再生◆雜種植物的鑒定第35頁/共62頁第三十五頁，共63頁。3、誘導原生質(zhì)體融合的方法及融合劑◆鹽類融合法◆高Ca2+和高pH值融合◆聚乙二醇（PEG）融合法◆PEG與高Ca2+和高pH值結(jié)合融合法◆電融合法第36頁/共62頁第三十六頁，共63頁?；仡櫍赫T導動物細胞融合的方法1、病毒誘導細胞融合2、化學融合劑誘導細胞融合3、電融合法第37頁/共62頁第三十七頁，共63頁。A.鹽類融合法鹽類融合劑種類硝酸鹽類：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物類：NaCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2葡聚糖硫酸鹽類：葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖硫酸鈉鹽類融合的優(yōu)缺點優(yōu)點：鹽類融合劑對原生質(zhì)體的活力破壞力小缺點：融合頻率低，對液泡化發(fā)達的原生質(zhì)體不易誘發(fā)融合第38頁/共62頁第三十八頁，共63頁。B.高Ca2+和高pH值融合Ca2+濃度0.05mol/L第39頁/共62頁第三十九頁，共63頁。具體做法(以煙草為例)取分離、純化好的兩種親本原生質(zhì)體以1:1的比例混合;加入2.2H2O和甘露醇;再用甘氨酸鈉緩沖pH值到，成為融合液，同時在37℃下保溫0.5h;用甘露醇洗凈高CaCl2和高pH值；兩種原生質(zhì)體的融合率達到10%。第40頁/共62頁第四十頁，共63頁。C.聚乙二醇（PEG）融合法Polyethyleneglycol(PEG)是一種多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH,平均相對分子量200-20000之間融合機制：可能是由于帶有大量負電荷的PEG分子和原生質(zhì)體表面的負電荷間在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著結(jié)合用相對分子質(zhì)量為1540的PEG處理40-50min；再用培養(yǎng)液緩慢稀釋PEG最后洗去PEG，得到10%的異核體第41頁/共62頁第四十一頁，共63頁。D.PEG與高Ca2+和高pH值結(jié)合融合法先用PEG處理30min；（PEG是相鄰原生質(zhì)體表面間的分子橋）然后用高Ca2+和高pH值液，稀釋PEG；（引起原生質(zhì)體表面電荷的紊亂和再分布，從而促進了融合）再用培養(yǎng)液洗去高Ca2+和高pH值第42頁/共62頁第四十二頁，共63頁。PEG誘導原生質(zhì)體融合過程第43頁/共62頁第四十三頁，共63頁。E.電融合法原理： 改變原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。優(yōu)點： 對原生質(zhì)體的損害小，融合率高，重復性強；裝置精巧、方便簡單，可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程，免去PEG誘導后的洗滌過程，誘導過程可控性強。第44頁/共62頁第四十四頁，共63頁。電融合基本過程將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室，微電極型只有一個小室，平行電極型有4個小室，兩電極間隔3mm，整個裝置放在一個培養(yǎng)皿中微電極型：用5-12微安的脈沖電流間斷刺激1-5毫秒，原生質(zhì)體在幾秒到幾十秒鐘的時間內(nèi)會發(fā)生暫時性的收縮，兩層膜之間形成小孔，連接成橋，形成一個個泡囊，經(jīng)點連接到面連接，最后形成融合體,整個過程約10-30分平行多電極融合裝置法：經(jīng)過1兆赫如150V/cm交流電場發(fā)生雙向電脈沖，原生質(zhì)體在電場力的作用下，極化產(chǎn)生偶極子，原生質(zhì)體緊密排開成串珠狀。在適當時間和強度的直流電脈沖(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，質(zhì)膜發(fā)生被擊穿，進一步形成融合體第45頁/共62頁第四十五頁，共63頁。細胞電融合過程第46頁/共62頁第四十六頁，共63頁。第47頁/共62頁第四十七頁，共63頁。原生質(zhì)體的融合過程包括3個主要階段：1)兩個或多個原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近；2)局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合；3)融合完成，形成球形的異核體或同核體。第48頁/共62頁第四十八頁，共63頁。4、細胞融合的影響因素PEG誘導法：PEG規(guī)格、純度，作用時間電誘導法：原生質(zhì)體密度交流電壓交變電場的振幅頻率交變電場的處理時間直流高頻電壓脈沖寬度脈沖次數(shù)第49頁/共62頁第四十九頁，共63頁。5、雜種細胞的選擇和鑒定A、融合體的類型B、雜種細胞選擇的方法C、細胞雜種的鑒定第50頁/共62頁第五十頁，共63頁。A、融合體的類型自體融合：發(fā)生在親本原生質(zhì)體自身異體融合諧和的細胞雜種：具有雙親全套染色體組的異源兩倍體部分諧和的細胞雜種：雙親的染色體經(jīng)逐步排斥，便發(fā)生少量染色體的重組，然后進入同步分裂，最后形成帶有部分重組染色體的植株異胞質(zhì)體細胞雜種：親本的染色體全部被排斥，但胞質(zhì)是雙親的嵌合細胞雜種：不同種的雙親原生質(zhì)體，發(fā)生了膜融合和胞質(zhì)融合，尚未發(fā)生核融合。雙親的細胞核各自發(fā)生核分裂，接著形成細胞壁，最終形成嵌合體植物第51頁/共62頁第五十一頁，共63頁。B、雜種細胞選擇的方法互補選擇法(遺傳或抗性)： 選擇一個葉綠體缺失突變體，這一突變體在限定培養(yǎng)基上，能分裂、分化形成植株。具有正常葉綠素的植株，在上述限定培養(yǎng)基上，則不能分裂形成大細胞團（愈傷組織）可見標記法： 凹穴培養(yǎng)皿分離法：根據(jù)融合后異核體和親本原生質(zhì)體的形態(tài)特征之區(qū)別 微吸管分離法：用一種向吸管根據(jù)可見標記吸取異核體，進行“看護培養(yǎng)”，以獲得雜種植物第52頁/共62頁第五十二頁，共63頁。生長特性選擇法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細胞。物理特性選擇法：利用親本原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電脈差異率等差異選擇雜種。其他方法：如采用顯微操作技術(shù)也能把單個異核體分離出來進行培養(yǎng)。第53頁/共62頁第五十三頁，共63頁。異硫氰酸熒光素（FITC）和異硫氰酸羅丹明（RITC）分別發(fā)出綠色和紅色◆熒光染料法兩個親本原生質(zhì)體在融合前用能發(fā)不同顏色熒光的熒光染料進行染色。細胞分類器辨別和收集發(fā)兩種熒光的異核體。但儀器價格昂貴，不常用。第54頁/共62頁第五十四頁，共63頁。第55頁/共62頁第五十五頁，共63頁。第56頁/共62頁第五十六頁，共63頁。C、細胞雜種的鑒定（1）雜種植物形態(tài)特征、特性鑒定（2）雜種植物的核型分析（3）同工酶分析（4)分子標記鑒定：RFLP鑒定、RAPD 標記鑒定第57頁/共62頁第五十七頁，共63頁。幾種細胞融合成功的例子融合生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間葉——葉1972甘藍——青菜葉——根1972大豆——馬唐草愈傷組織——葉1972矮牽?！埫婊ㄈ~——花瓣1973大麥——花生種子——種子1974大麥——大豆葉——懸浮細胞1974小麥——矮牽牛葉——花瓣1974玉米——大豆葉——懸浮細胞