華北大黑鰓金龜幼蟲腸道菌的分離及對農藥的降解

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材料與方法

1.1供試材料

華北大黑金龜鰓幼蟲：取冬眠期幼蟲。

1.2培養(yǎng)基

TNYE培養(yǎng)基：酵母膏0.25g，K2HPO40.5g，瓊脂15.0g，pH值為7.2，NaCl10%，水1L，pH值7.2。

淀粉-酪素培養(yǎng)基：葡萄糖5g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏1g，CaCO32g，瓊脂15g，pH值7.2，NaCl10%，水1L，pH值7.2。

甘油天門冬氨酸培養(yǎng)基：甘油10g，L-天冬氨酸1g，K2HPO41g，MgSO40.1g，瓊脂15g，pH值7.2，NaCl10%，水1L，pH值7.2。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉20.0g，磷酸氫二鈉2.5g，磷酸二氫鉀1.5g，蛋白胨2.5g，酵母膏0.5g，瓊脂15.0g，水1L，pH值7.2。

ISP2培養(yǎng)基：酵母提取物4g，麥芽提取物10g，葡萄糖4g，水1L，瓊脂15g，pH值7.2。

LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，瓊脂15g，pH值7.0。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，20g瓊脂，1L水。

根基鹽培養(yǎng)基：

NaCl1.00g，NH4NO31.00g，K2HPO41.50g，KH2PO40.50g，MgSO4·7H2O0.10g，水1L，pH值7.0。

1.3金龜幼蟲腸道微生物的分開

清洗5支試管，每支試管注入10mL蒸餾水，加上試管塞，用高溫滅菌鍋121℃滅菌20min，取出后使其冷卻至室溫，并標上編號為1、2、3、4、5。開啟無菌操作臺舉行紫外滅菌。選取冬眠的金龜幼蟲放入75%的乙醇中浸泡2min，在無菌操作臺上取出蟲體放在培養(yǎng)皿中無菌解剖。取少量腸道里白色物質，放入標號為1的試管，然后蓋上試管塞晃動使微生物分布平勻，取出后在無菌操作臺上舉行梯度稀釋。從稀釋103倍和104倍的菌液中取50μL，分別滴入供分開用的培養(yǎng)基中（分開培養(yǎng)基：TNYE培養(yǎng)基，淀粉-酪素培養(yǎng)基，甘油天門冬氨酸培養(yǎng)基，羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基），涂布平勻，把培養(yǎng)皿倒置放入恒溫保溫箱內30℃培養(yǎng)8d。查看菌落生長處境，統(tǒng)計菌落數(shù)，并挑取片面菌株轉接于試管中保存。

1.4片面分開菌株的初步鑒定

通過測定16SrRNA基因序列舉行初步鑒定，分開菌株總DNA的提取參照文獻[11]的方法舉行，PCR擴增采用細菌16SrRNA通用引物（27F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；1492R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）。PCR回響條件為：94℃5min；95℃1min，55℃1min，72℃90s，共35個循環(huán)，72℃10min。PCR產(chǎn)物用經(jīng)EB染色的0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序。依照測序結果，從NCBI（http：///Blast.cgi）數(shù)據(jù)庫中調出好像性較高相關菌株的16SrRNA基因序列，舉行序列比對分析。

1.5降解辛硫磷和毒死蜱菌株的篩選

配制含辛硫磷和毒死蜱有效成分100mg/L根基鹽培養(yǎng)基，將分開獲得的菌株接種于培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長狀況良好（能形成菌落）的即定為可降解菌。

2結果與分析

2.1各培養(yǎng)基菌株分開處境

由表1可知，選用的4種培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物，淀粉-酪素培養(yǎng)基獲得的微生物數(shù)量最多，0.5g濕樣/mL在稀釋103倍下平板菌落數(shù)162個，稀釋104倍下獲得菌落數(shù)36個，羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基次之，甘油天門冬氨酸培養(yǎng)基最差，在稀釋103倍下平板菌落數(shù)為30個。

2.2分開獲得的菌株種類處境

從各種培養(yǎng)基中共挑取菌株65株，細菌保存于含LB培養(yǎng)基斜面試管中，放線菌保存于含ISP2培養(yǎng)基斜面試管中，從65株菌株挑取了13株有代表性的菌株舉行測序分析，由比對結果（表2）可知，幼蟲腸道微生物至少包括原小單孢菌屬（Promicromonospora）、纖維微菌屬（Cellulosimicrobium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、冢村氏菌屬（Tsukamurella）、壤霉菌屬（Agromyces）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、詹森菌屬（Janthinobacterium）、小單孢菌屬（Micromonospora）、鏈霉菌屬（Streptomyces）等9個屬。

2.3腸道微生物對2種農藥的降解處境

挑揀片面獲得的菌株，舉行降解毒死蜱和辛硫磷的試驗，結果見表3。

供試的28株菌株中，在以毒死蜱（濃度100mg/L）為唯一碳源的根基鹽培養(yǎng)基中，能形成菌落的菌株為8株，占供試菌株28%，在以辛硫磷為唯一碳源的根基鹽培養(yǎng)基中，能形成菌落的菌株為19株，占供試菌株67.8%，對毒死蜱和辛硫磷都能降解的有CH1、CH19、CH32、CH33、CH44、CH47（Sac

3議論

華北大黑鰓金龜幼蟲腸道微生物的分開試驗選用的4種培養(yǎng)基中，淀粉-酪素培養(yǎng)基分開效果最好，甘油天門冬氨酸培養(yǎng)基分開效果最差。因此，在做腸道微生物分開試驗時建議使用淀粉-酪素培養(yǎng)基。

通過研究說明，一些腸道微生物對農藥有降解作用，本試驗中，華北大黑鰓金龜幼蟲腸道微生物對辛硫磷降解作用優(yōu)于毒死蜱，說明在防治華北大黑鰓金龜時，毒死蜱防治效