蛋白質(zhì)的通性純化和表征詳解

第3章蛋白質(zhì)的通性、純化和表征一、

蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。等電點(diǎn)：蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零的pH值稱為等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)在電場中不移動,溶解度最小，粘度最大?？梢杂萌芙舛确ǎ劢闺娪痉ǖ葴y定等電點(diǎn)。二、

蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)分子直徑在1-100nm之間，在水溶液中具有膠體溶液的通性。1、

穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素：①蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水化膜將蛋白質(zhì)顆粒彼此隔開，不會互相碰撞凝聚而沉淀；②兩性電解質(zhì)非等電狀態(tài)時，帶同種電荷，構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層，互相排斥不致聚集沉淀。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。一旦電荷被中和或水化膜被破壞，蛋白質(zhì)顆粒聚集，便從溶液中析出沉淀。2、

沉淀蛋白質(zhì)的方法①鹽析法:大量的中性鹽（（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl），使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀；不引起變性。②有機(jī)溶劑沉淀法：破壞水化膜，降低介電常數(shù)，丙酮、乙醇等；③重金屬鹽沉淀：pH＞pI時，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，與重金屬離子（Hg2+.Pb2+.Cu2+

等）結(jié)成不溶性沉淀；④生物堿試劑和某些酸類沉淀法：pH小于pI時，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：單寧酸、苦味酸、鎢酸。酸類：三氯乙酸、磺基水楊酸；⑤加熱變性沉淀法。三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則純化的實(shí)質(zhì)：增加制品的純度或比活性一般程序：前處理、粗分級分離、細(xì)分級分離、結(jié)晶保存

電泳

前處理粗分離細(xì)分離生物組織

無細(xì)胞提取液破碎、溶解、差速離心選擇性沉淀法親和層析離子交換層析精制后的蛋白質(zhì)凝膠過濾疏水層析吸附層析1、前處理（pretreatment）：①將組織和細(xì)胞破碎動物組織和細(xì)胞：電動搗碎機(jī)、勻漿器、超聲波處理；植物組織和細(xì)胞：石英砂+提取液研磨或用纖維素酶處理；細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理（分解肽聚糖）②如果所要蛋白質(zhì)集中在某一細(xì)胞組分，用差速離心法收集細(xì)胞的某一組分（表7－5）；③如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。2、粗分級分離（roughfractionation)一般用選擇性沉淀法。①（NH4）2SO4分級沉淀法（鹽析）②等電點(diǎn)選擇性沉淀法③有機(jī)溶劑分級沉淀法3、細(xì)分級分離（finefractionation))★層析法：凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相HPLC）★電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳等）、等電聚焦、雙向電泳★密度梯度離心4、結(jié)晶（晶體保存）結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度的一個指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。結(jié)晶方法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH。四、

蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小的差異透析法：將樣品裝在透析袋里，半透膜阻留pr分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以達(dá)到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。①透析和超過濾法：都是利用蛋白質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)除去樣品中的小分子非蛋白物質(zhì)超過濾法：施以一定的壓力強(qiáng)迫小分子物質(zhì)通過半透膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子。②凝膠過濾法（分子篩層析法）

凝膠過濾常用的介質(zhì)：在層析柱內(nèi)裝填帶有小孔的凝膠顆粒。交聯(lián)葡聚糖（Sephadex，是由葡聚糖與環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)形成的有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物）。

聚丙烯酰胺凝膠瓊脂糖凝膠凝膠過濾的原理（二）根據(jù)溶解度差異的分離法蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析鹽溶：是指在適當(dāng)?shù)闹行喳}濃度溶液中，蛋白質(zhì)溶解度會提高的現(xiàn)象，稱鹽溶。鹽析：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽（高鹽濃度）時，會破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層（即破壞了蛋白質(zhì)在水溶液的穩(wěn)定性因素）導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度降低發(fā)生沉淀析出，稱鹽析。常用的飽和硫酸銨沉淀法分離純化蛋白質(zhì)就是利用鹽析的原理，不同的蛋白質(zhì)對飽和硫酸銨的要求不同，所以，可以通過飽和硫酸銨的分級沉淀法分離各種蛋白質(zhì)。（三）根據(jù)電荷性質(zhì)的差異1、電泳法電泳：帶電荷的蛋白質(zhì)或核酸分子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳。帶正電荷向負(fù)極泳動，而帶負(fù)電荷向正極泳動，分子量小的蛋白質(zhì)泳動快，分子量大的泳動慢，于是蛋白質(zhì)被分離。影響因素①電荷、粒子的大小和溶液的粘度②電場強(qiáng)度③溶液的pH2.聚丙烯酰胺凝膠電泳

基本原理：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，根據(jù)被分離物質(zhì)所帶電荷的多少、分子形狀、分子大小的不同，在電場的作用下產(chǎn)生不同的移動速度而分離的方法。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑和加速劑的作用下聚合而成。網(wǎng)狀的大小決定于單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度及兩者的比例。SDS(sodiumdodecylsulfate)若果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS，SDS是一種陰離子表面活性劑，幾乎能破壞蛋白質(zhì)中所有的非共價鍵，從而使多亞基蛋白質(zhì)解聚，并使多肽鏈呈伸展?fàn)顟B(tài)，消除了蛋白質(zhì)形狀對遷移率的影響；SDS能以1:2比例與肽鏈中的氨基酸殘基結(jié)合，使變性蛋白質(zhì)帶上大量的凈負(fù)電荷，多肽鏈上帶的負(fù)電荷量遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，結(jié)果所有的SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳時都以幾乎同樣的電荷質(zhì)量比向正極移動并具有相同的構(gòu)象，所以同一電泳條件下，分子量成為決定蛋白質(zhì)泳動速率的唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳動越慢。3.等電聚焦（1）基本原理根據(jù)蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)進(jìn)行分離。利用這種技術(shù)分離蛋白質(zhì)混合物是在具有pH梯度的介質(zhì)中進(jìn)行，在外加電場作用下，各種蛋白質(zhì)將移向并聚集（停留）在等于其等電點(diǎn)的pH梯度處，并形成一個很窄的區(qū)帶。（2）優(yōu)點(diǎn)及主要用途加樣位置和體積不受嚴(yán)格限制，分辨率很高，可測定pI，分離速度快，分離的蛋白質(zhì)不變性?？捎糜诘鞍踪|(zhì)和兩性分子的分離分析和蛋白質(zhì)pI的測定。（3）基本操作1、膠的制備(需兩性電解質(zhì)）2、加樣和電泳3、染色和脫色（1）基本原理利用被分離物質(zhì)的電荷與層析載體電荷的相互作用達(dá)到分離純化?；|(zhì)：纖維素、交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、層析載體由基質(zhì)和帶電基團(tuán)組成4、離子交換層析法：層析載體的種類：①陽離子交換劑（帶負(fù)電）如：磺丙基（強(qiáng)酸型）SP-Sephadex-O-(CH2)3-SO3H②陰離子交換劑（帶正電）如：二乙基氨基乙基（中強(qiáng)堿型）蛋白質(zhì)與離子交換劑間的主要作用：靜電引力（2）基本操作1、樣品準(zhǔn)備2、離子交換劑和層析柱的制備選擇合適的離子交換劑，進(jìn)行預(yù)處理，柱床體積為樣品體積的2-5倍。3、上樣。4、目的蛋白的洗脫洗脫方式有逐步提高洗脫液的鹽濃度（離子強(qiáng)度）和逐步提高洗脫液的pH。5、洗脫液的鑒定和回收蛋白質(zhì)成分常用280nm紫外吸收法監(jiān)測（四）親和層析親和層析：利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識別能力，建立起來的一種有效的純化方法。配基：酶的底物、輔酶、抑制劑、效應(yīng)物及其結(jié)構(gòu)類似物，激素與受體蛋白，抗原與抗體等。親和層析的原理：親和層析的原理五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定1、凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠或稱為凝膠顆粒，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠顆粒中具有大量微孔，這些微孔只允許較小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而大于膠粒微孔的分子則被排阻在外洗脫時大分子隨洗脫液先流下來，洗脫液體積?。恍》肿釉陬w粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大測定蛋白質(zhì)分子量一般用交聯(lián)葡聚糖作為凝膠，商品名：Sephadex測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積〔Ve〕以相對分子質(zhì)量對數(shù)（logM）對Ve作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線再測出未知樣品洗脫體積〔Ve〕從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量2.SDS—PAGE（十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳）用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與SDS結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)值對它們的相對遷移率作圖測出待測樣品的相對遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對分子質(zhì)量★影響遷移率的主要因素凝膠的分子篩效應(yīng)對長短不同的棒形分子會產(chǎn)生不同的阻力〔主要因素〕凝膠的濃度和交聯(lián)度同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動快，遷移率大。相對分子質(zhì)量大者，遷移率小★優(yōu)點(diǎn)：快速，樣品用量少，可同時測幾個樣品缺點(diǎn)：誤差大，約為±10％（誤差主要來源于遷移距離的測量誤差）★此方法只能測得亞基肽鏈的相對分子質(zhì)量六、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定總蛋白含量分析：凱氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外吸收法考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）：考馬斯亮藍(lán)G250是一種帶有負(fù)電荷的染料，在酸性條件下可與Pr上的正電荷結(jié)合，形成藍(lán)色化物，在595nm具有特定吸收。紫外吸收法：由于核酸在260nm具有光吸收，對測定干擾較大，可采用280nm、260nm同測法。

蛋白質(zhì)濃度mg/ml＝1.45A280-0.74A260

（一