第四五章噬菌體載體及粘粒及目的基因的準(zhǔn)備重組及重組子的鑒定詳解演示文稿

第四五章噬菌體載體及粘粒及目的基因的準(zhǔn)備重組及重組子的鑒定詳解演示文稿第一頁，共三十六頁。優(yōu)選第四五章噬菌體載體及粘粒及目的基因的準(zhǔn)備重組及重組子的鑒定第二頁，共三十六頁。第三頁，共三十六頁。第四頁，共三十六頁。三、噬菌體的體外包裝*重組體DNA分子的轉(zhuǎn)染(transfection)作用105~106噬菌斑/gDNA*體外包裝轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)第五頁，共三十六頁。天然包裝過程第六頁，共三十六頁。體外包裝過程尾部突變-頭頭部突變-尾E-72%E--累積尾部蛋白D-與DNA進入頭部及頭部成熟有關(guān)D--累積頭部蛋白第七頁，共三十六頁。四、凱倫噬菌體載體(charon)兩類特點：酶切位點多、含LacZ、容量大克隆程序:分離線性噬菌體DNA-酶切分離左右臂+中央?yún)^(qū)段-與外源DNA混合-包裝幾kb~23kb噬菌體載體及派生載體的優(yōu)點：感染效率高第八頁，共三十六頁。五、柯斯質(zhì)粒載體1、柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建定義：(cossite-carryingplasmid)eg.pHC79(+pBR322)cos+與噬菌體包裝有關(guān)的序列ori+Ampr+Tetr容量：31~45kb第九頁，共三十六頁。第十頁，共三十六頁。2、柯斯質(zhì)粒載體的特點*具有噬菌體的特性（環(huán)化）*具有質(zhì)粒載體的特性*高容量3、柯斯克隆優(yōu)點：容量大、非重組體少問題：分子內(nèi)重組成多聚體（堿性磷酸酶處理）基因間連接（電泳分級分離）第十一頁，共三十六頁。第十二頁，共三十六頁。六、單鏈DNA噬菌體載體*M13、f1、fd*優(yōu)點：雙鏈復(fù)制型、單雙鏈均可轉(zhuǎn)染宿主、顆粒大小受DNA多寡制約、易測出插入方向*M13克隆體系特性：LacZ、誘導(dǎo)及組成型的LacZ、成對構(gòu)建（M13mp8、M13mp9）

第十三頁，共三十六頁。第十四頁，共三十六頁。七、噬菌體展示載體(phagedisplay)絲狀噬菌體（M13/fd)表面-3~5拷貝geneIII產(chǎn)物-顆粒組裝及F性須吸附G.P.Smith-1985建立-在噬菌體表面表達(dá)蛋白應(yīng)用：噬菌體表面展示文庫*原理*分離hGH變體第十五頁，共三十六頁。第十六頁，共三十六頁。第十七頁，共三十六頁。第十八頁，共三十六頁。八、噬菌粒載體(phasmid)M13類的缺陷：-插入后遺傳穩(wěn)定性下降，且與片段大小有關(guān)-實際上總以正向插入-容量有限（1500bp）改進的M13類-噬菌粒-分子?。?kb-容量10kb-雙向性（細(xì)菌質(zhì)粒和phage）第十九頁，共三十六頁。第二十頁，共三十六頁。T3+T7第二十一頁，共三十六頁。1、噬菌體載體的類型及其比較。2、噬菌體的體外包裝原理。3、什么是凱倫噬菌體載體？有怎樣的特點？4、什么是柯斯質(zhì)粒載體？有怎樣的特點？5、單鏈DNA噬菌體載體的優(yōu)點。6、噬菌體展示載體的工作原理。7、噬菌粒載體的特點。復(fù)習(xí)提綱第二十二頁，共三十六頁。第五章目的基因的準(zhǔn)備、重組及重組子的鑒定一、cDNA基因文庫的構(gòu)建（匯集生物體所有cDNA序列的重組DNA群體）1、cDNA基因文庫的優(yōu)點：病毒RNA篩選簡單表達(dá)測定基因結(jié)構(gòu)（內(nèi)含子外顯子）、時間調(diào)節(jié)基因表達(dá)特征分析2、缺點：無調(diào)節(jié)序列低豐度mRNA克隆難第二十三頁，共三十六頁。

Clerke&Carbon公式：N=ln(1-p)/ln(1-f/g)特異mRNA拷貝數(shù)/總mRNA種類可克隆片段大小/基因組總長度mRNA豐度克隆基因的大小(載體容量)10670/29%=87000N=ln(1-99%)/ln(1-1/87000)=1.7x105第二十四頁，共三十六頁。3、RNA的制備及純化總RNA的提取mRNA的純化-oligodT-纖維素柱層析特異mRNA的富集（mRNA分級分離、蔗糖密度梯度離心）特異mRNA的分析鑒定*mRNA體外翻譯（麥胚、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞）*RNA電泳-NorthernBlot第二十五頁，共三十六頁。4、cDNA兩鏈的合成5、雙鏈cDNA分子與載體的連接*同聚物加尾*linker-連接子6、重組體導(dǎo)入宿主轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電脈沖第二十六頁，共三十六頁。RNaseH方法第二十七頁，共三十六頁。Self-priming第二十八頁，共三十六頁。同聚物加尾第二十九頁，共三十六頁。重組-linker第三十頁，共三十六頁。二、cDNA基因文庫的篩選與特異重組體的鑒定1、遺傳檢測*利用載體提供的表型特征*插入基因功能表達(dá)2、物理檢測*凝膠電泳第三十一頁，共三十六頁。3、核酸探針（screeningalibrary)第三十二頁，共三十六頁。4、免疫化學(xué)檢測*標(biāo)記抗體探針*免疫沉淀5、轉(zhuǎn)譯篩選法*雜交抑制的轉(zhuǎn)譯-豐富mRNA*雜交選擇的轉(zhuǎn)譯-低豐度mRNA-insulin6、正負(fù)篩選法組織特異性、發(fā)育階段特異性、特殊處理后基因表達(dá)差異第三十三頁，共三十六頁。第三十四頁，共三十六頁。三、基因組DNA文庫的構(gòu)建與篩選1、基因組DNA文庫：匯集生物體所有DNA序列的重組DNA群體2、目的研究結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控序列基因組結(jié)構(gòu)3、目的基因的準(zhǔn)備*限制酶切法-鳥槍法(shot-gu