生化藥物與基因工程藥物分析

生化藥物與基因工程藥物分析第一頁，共四十七頁，2022年，8月28日

第一節(jié)概述

第二頁，共四十七頁，2022年，8月28日

第一節(jié)概述

第一代生物藥物：生物體某些天然活性物質(zhì)加工制成，例如胎盤制劑第二代：利用生化技術(shù)從生物材料中分離、純化獲得的，例如純化胰島素第三代：利用生物技術(shù)生產(chǎn)的天然生化物質(zhì)及經(jīng)過生物工程手段改造的新物質(zhì)第三頁，共四十七頁，2022年，8月28日一、生物藥物的概念利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合應(yīng)用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)和藥學(xué)的原理與方法制的的一類藥物廣義：從動物、植物、微生物等生物體中制取的各種天然生物活性物質(zhì)以及人工合成或半合成的天然物質(zhì)類似物第四頁，共四十七頁，2022年，8月28日（一）生化藥物：利用生物化學(xué)的理論、方法和技術(shù)，從動物、植物以及微生物等生物體中提取分離的天然活性物質(zhì)，以及這些物質(zhì)及其衍生物的化學(xué)合成、半合成和現(xiàn)代生物技術(shù)制的的產(chǎn)品。例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。第五頁，共四十七頁，2022年，8月28日（二）生物技術(shù)藥物生物技術(shù)：利用生物體或其組成部分發(fā)展產(chǎn)品的技術(shù)體系，生物技術(shù)作為一種手段可用以研究和開發(fā)新藥。生物技術(shù)藥物（生物工程藥物）：用生物技術(shù)研制的藥物第六頁，共四十七頁，2022年，8月28日（三）基因工程藥物先確定對某種疾病具有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制蛋白質(zhì)合成過程的基因分離、純化或進(jìn)行人工合成，利用重組DNA技術(shù)加以改造，最后將該基因放入可以大量生產(chǎn)的受體細(xì)胞中不斷繁殖或表達(dá)，并能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)具有預(yù)防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)第七頁，共四十七頁，2022年，8月28日（四）生物制品應(yīng)用普通的或以基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及各種動物或人源組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病的預(yù)防、治療和診斷的藥品。第八頁，共四十七頁，2022年，8月28日生物制品的分類預(yù)防：菌苗（卡介苗）、疫苗（乙肝疫苗）、類毒素（破傷風(fēng)類毒素）治療：特異性治療用品（狂犬病免疫球蛋白）、非特異性治療用品（白蛋白）診斷：免疫診斷用品（結(jié)核菌素）第九頁，共四十七頁，2022年，8月28日

1.生物體的基本生化成分

來自生物體，參與、調(diào)控和影響人體代謝和生理功能，在某些疾病治療時具有針對性強(qiáng)、毒副作用小的特點(diǎn)。部分蛋白質(zhì)藥物，極微量就可產(chǎn)生顯著效果。

2.分子量大:

分子量一般為幾千至幾十萬，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，甚至不確定，分析和檢驗(yàn)困難，常需純度分析和分子量測定。

二、藥物治療控制的特點(diǎn)第十頁，共四十七頁，2022年，8月28日3.結(jié)構(gòu)難確證：各種技術(shù)

4.全過程的質(zhì)量控制：

對酸、堿、熱、pH等敏感，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件和鑒定質(zhì)量。基因工程藥物比傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的藥物要求更高。

5.生物活性檢查

多肽、蛋白質(zhì)類藥物，除采用理化檢驗(yàn)外，還需采用生物鑒定法證實(shí)其生物活性。

二、藥物治療控制的特點(diǎn)第十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日6.安全性檢查

熱源檢查、過敏實(shí)驗(yàn)、致突變實(shí)驗(yàn)

7.效價（含量）測定：

理化法：生物藥物和基因工程藥物

效價測定和活性測定：酶類藥物

二、藥物治療控制的特點(diǎn)第十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日第二節(jié)質(zhì)量控制的項目和方法來源和種類性狀鑒別檢查含量測定第十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日

一、鑒別試驗(yàn)

理化鑒別法：化學(xué)鑒別法

紫外分光光度法

HPLC法

生化鑒別法：酶法

電泳法

樣品脫鹽后等電點(diǎn)聚焦法測定

生物鑒別法：血清學(xué)法

生物學(xué)法第十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日（一）理化鑒別法

1.化學(xué)鑒別法：

例：溶菌酶+Cu2+絡(luò)合顯色第十五頁，共四十七頁，2022年，8月28日

2.紫外分光光度法

最大吸收波長固定不變，紫外光譜圖一致

溶劑：0.01mol/L鹽酸例：三磷酸腺苷二鈉濃度：20μg/ml

判斷：λmax：257±1nm

3.HPLC法：

利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時間和肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。

第十六頁，共四十七頁，2022年，8月28日

（二）生化鑒別法1.酶法：例：尿激酶的鑒別氣泡上升法原理：第十七頁，共四十七頁，2022年，8月28日

方法：取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置37℃±0.5℃恒溫水浴保溫，記時。反應(yīng)系統(tǒng)在30～40秒內(nèi)凝結(jié)，凝結(jié)塊內(nèi)有氣泡生成，15分鐘內(nèi)凝結(jié)塊溶解，當(dāng)凝結(jié)塊溶解時，氣泡逐漸上升。以0.9%氯化鈉作空白，同法操作，凝結(jié)塊在2小時內(nèi)不溶。第十八頁，共四十七頁，2022年，8月28日2.電泳法：帶電荷的供試品在惰性支持介質(zhì)中，與電場的作用下，按各自的速度向其對應(yīng)的電極方向泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶。第十九頁，共四十七頁，2022年，8月28日2.電泳法：以肝素鑒別為例。與國家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對照，其移動位置相應(yīng)。第二十頁，共四十七頁，2022年，8月28日3.

樣品脫鹽后等電點(diǎn)聚焦法測定基因工程藥物等電點(diǎn)不一致同一產(chǎn)品，不管有幾個等電點(diǎn)，批與批之間必須一致第二十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日（三）生物鑒別法1.血清學(xué)法體外的抗原抗體試驗(yàn)。經(jīng)典血清學(xué)反應(yīng)：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、中和反應(yīng)和補(bǔ)給結(jié)合反應(yīng)免疫擴(kuò)散、免疫電泳以及熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記等高敏感的檢測技術(shù)第二十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日

2.生物法：利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別藥物。例：家兔驚厥試驗(yàn)鑒別胰島素。利用胰島素的降糖作用。給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。第二十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日

一般雜質(zhì)檢查：氯化物、硫酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度等特殊雜質(zhì)檢查：原料藥純度分析和生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查二雜質(zhì)檢查第二十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日（二）特殊雜質(zhì)檢查1.原料藥的純度分析多糖類純度分析：低聚糖及可能混入的核酸、蛋白質(zhì)2.生成過程中雜質(zhì)的檢查有傳統(tǒng)生產(chǎn)方法不可能存在的有害雜質(zhì)，如內(nèi)毒素、致敏原第二十五頁，共四十七頁，2022年，8月28日生化藥物和基因藥物的含量表示方法：

百分含量：適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥

物或經(jīng)水解后變成小分子的

藥物。

生物效價或酶活力單位：適用于酶類、

蛋白質(zhì)類藥物。

三、含量（效價）測定第二十六頁，共四十七頁，2022年，8月28日第三節(jié)定量分析方法理化分析法生化測定法生物檢定法第二十七頁，共四十七頁，2022年，8月28日一、理化分析法（一）化學(xué)分析法重量法：根據(jù)樣品中分離出的單質(zhì)或化合物的重量測定所含成分的含量。滴定分析法：根據(jù)生物制品中某些成分能與標(biāo)準(zhǔn)溶液定量的發(fā)生酸堿中和反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等特性，通過滴定過程而進(jìn)行生物制品的含量測定的方法第二十八頁，共四十七頁，2022年，8月28日（二）電化學(xué)分析法電化學(xué)分析法：建立在物質(zhì)在溶液中的電化學(xué)性質(zhì)基礎(chǔ)上的一類儀器分析方法，通常將試液作為化學(xué)電池的一個組成部分，根據(jù)該電池的某種電參數(shù)（如電阻、電導(dǎo)、電位、電流、電量或電流-電壓曲線等）與被測物質(zhì)的濃度之間存在一定的關(guān)系而進(jìn)行測定的方法。第二十九頁，共四十七頁，2022年，8月28日（三）光譜法1.比色法供試品中某些成分可與顯色劑發(fā)生顏色反應(yīng)，根據(jù)顏色的深淺，與標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行同法處理后比較，即可測定含量。例：蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)第三十頁，共四十七頁，2022年，8月28日（三）光譜法2.紫外分光光度法：生物制品或相關(guān)的反應(yīng)產(chǎn)物的紫外光譜在某一特征波長處有最大吸收，且一定的濃度范圍內(nèi)與相應(yīng)的吸光度成正比，則可用于生物制品的含量測定第三十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日（三）光譜法3.熒光分光光度法：利用物質(zhì)吸收較短波長的光能后發(fā)射較長波長特征光譜的性質(zhì)，對物質(zhì)定性或定量分析的方法?？梢詮陌l(fā)射光譜或激發(fā)光譜進(jìn)行分析。該法靈敏度高(通常比紫外分光光度法高2～3個數(shù)量級)，選擇性好。第三十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日（四）高效液相色譜法具有高效分析、靈敏檢測、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)分離過程中不破壞分離樣品的特點(diǎn)適合于對高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的生物制品的定量分析第三十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日二、生化分析法

（一）酶法以酶為分析對象的分析：酶活力測定法目的是測酶的活性或活力以酶為分析工具或分析試劑的分析方法：酶分析法主要測定樣品中酶以外其他物質(zhì)的含量第三十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日1）基本概念：

酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力測定實(shí)質(zhì)上是測定一個被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度。酶反應(yīng)速度越快所表示的酶活力越高。

酶反應(yīng)速度可以用單位時間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。

1.酶活力測定法第三十五頁，共四十七頁，2022年，8月28日1）基本概念：

酶單位：任何一種酶，在25℃以最適當(dāng)?shù)牡孜餄舛取⒆钸m當(dāng)?shù)木彌_液離子強(qiáng)度以及最適當(dāng)?shù)膒H等條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個微摩爾底物的酶量定為一個活性單位（國際單位，IU）

1.酶活力測定法第三十六頁，共四十七頁，2022年，8月28日1）基本概念：

酶的比活性：為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg蛋白質(zhì)表示。

1.酶活力測定法第三十七頁，共四十七頁，2022年，8月28日酶反應(yīng)進(jìn)程曲線縱坐標(biāo)為底物或產(chǎn)物的變化量，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間，曲線斜率表示反應(yīng)速度。從酶反應(yīng)進(jìn)程曲線求得反應(yīng)的初速度。

酶濃度曲線縱坐標(biāo)為反應(yīng)速度，橫坐標(biāo)為酶量。通過酶濃度曲線檢驗(yàn)反應(yīng)測定系統(tǒng)是否適宜。

第三十八頁，共四十七頁，2022年，8月28日2）酶促反應(yīng)的條件及影響因素

底物的濃度：一般選用底物的濃度[S]=100Km。

pH：選用一個適宜的緩沖離子和離子強(qiáng)度、

適宜的pH值的緩沖系統(tǒng)來控制pH。

溫度：酶反應(yīng)的溫度通常選用25℃、30℃或

37℃，實(shí)驗(yàn)中溫度變動應(yīng)控制在±0.1℃以內(nèi)。

輔助因子：有些酶需要金屬離子，有些需要

相應(yīng)的輔酶。第三十九頁，共四十七頁，2022年，8月28日3）測定方法：取樣測定法、連續(xù)測定法取樣測定法：在酶反應(yīng)開始后不同的時間，從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量的反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻?yīng)后，再根據(jù)底物和產(chǎn)物在化學(xué)性質(zhì)上的差異，用適當(dāng)?shù)臋z測方法進(jìn)行定量分析，求得單位時間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。連續(xù)測定法：在反應(yīng)過程中對反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)監(jiān)測的方法。第四十頁，共四十七頁，2022年，8月28日4）酶活力測定的方法檢測方法：紫外-可見分光光度法旋光法熒光分光光度法電化學(xué)測定法酶偶聯(lián)測定法離子選擇性電極測定法等。

第四十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日2.酶分析法

分析對象是酶的底物、輔酶活化劑、酶的抑制劑。

1.動力學(xué)分析法

2.總變量分析法本法又稱為平衡法或終點(diǎn)法。

僅適用于底物的測定。第四十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日（二）電泳法

電泳法可分為三大類：自由界面電泳、區(qū)帶電泳、高效毛細(xì)管電泳（HPCE)。

根據(jù)所用支持物的不同分為：紙電泳法、醋酸纖維素薄膜電泳法、PAGE法、SDS法、瓊脂糖凝膠電泳法

第四十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日1、自由界面電泳：在一根U形管里的溶液中，同種分子的構(gòu)型及荷電情況基本一致，在電場影響下，它們逐漸密集而與其他電泳遷移率不同的物質(zhì)之間形成明顯的界面。第四十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日2、區(qū)帶電泳：在電泳過程中，應(yīng)用各種不同的惰性支持介質(zhì)，在電場作用下，