堿性磷酸酶的分離純化袁野

堿性磷酸酶(AKP)的分離純化實驗目的:

從兔肝中提取堿性磷酸酶的實驗，培養(yǎng)同學綜合運用有機溶劑沉淀、離心、分光等方法，從組織中分離純化及鑒定特定蛋白質(zhì)的技能。實驗原理：采用有機溶劑分步沉淀法，從兔肝中提取堿性磷酸酶。

AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中則形成沉淀。通過離心可以使AKP和其他蛋白分離，從而得到純化。反復進行純化的操作，可以獲得較高純度的AKP。有機溶劑沉淀概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。原理：（1）降低了溶質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導致沉淀。（2）由于有機溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質(zhì)表面水化層的厚度，降低了親水性，導致脫水凝聚。常用的有機溶劑沉析劑乙醇：沉析作用強，揮發(fā)性適中，無毒常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣；特點：介電常數(shù)小:60%乙醇的介電常數(shù)是48

丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取有機溶劑沉析的特點分辨率高；溶劑容易分離，并可回收使用；產(chǎn)品潔凈；容易使蛋白質(zhì)等生物大分子失活；應注意在低溫下操作；影響有機溶劑沉析的主要因素溫度：低溫有利于防止溶質(zhì)變性；有利于提高收率（溶解度下降）；攪拌速度：散熱溶液pH值：原則是避免目標蛋白與雜質(zhì)帶有相反的電荷，防止共沉現(xiàn)象。（pI）離子強度:離子強度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L樣品濃度:0.5~2%

?。喝軇┯昧看螅厥章实?，但共沉淀作用小 濃：節(jié)省溶劑用量，共沉作用強，分辨率低金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+1.稱取兔肝2g,剪碎后置于玻璃勻漿器中，加入0.01M的醋酸鎂及醋酸鈉混合液4ml,進行勻漿。轉(zhuǎn)入離心管，并加2ml0.01M的醋酸鎂及醋酸鈉混合液清洗勻漿器，之后將之倒入離心管，與原來的勻漿液混合。記錄體積a，取0.1ml作為A液于EP管，待測比活性用。在離心管中剩余的液體加入2ml正丁醇，玻璃棒攪拌2min，室溫放置30min，紗布過濾，置于離心管。濾液加入等體積的冷丙酮，邊倒邊搖，混勻后3000r/min5min。棄上清，沉淀用4ml0.5MMg(AC)2溶解。記錄體積b。取0.1ml作為B液于EP管，待測比活性用。4.(1)于懸液中緩慢加入冷95%乙醇使其終體積為30%（0.46體積），混勻后2000r/min5min，轉(zhuǎn)移上清于另一離心管。(2)上清液中緩慢加入冷95%乙醇使其終體積為60%（0.85體積），混勻后3000r/min5min，棄上清，沉淀用4ml0.01MMg(AC)2、NaAC混合液攪拌混懸。5.(1)于懸液中緩慢加入冷95%乙醇使其終體積為30%（0.46體積），混勻后2000r/min5min，轉(zhuǎn)移上清于離心管，棄沉淀。(2)上清液中緩慢加入冷95%乙醇使其終體積為60%（0.85體積），混勻后3000r/min5min，棄上清，沉淀用3ml0.5MMg(AC)2溶解,記錄體積c。取0.1ml作為C液于EP管,待測比活性用。6.（1）其余懸液中緩慢加入冷丙酮，使得丙酮的體積分數(shù)達到33%（0.5體積），混勻后2000r/min離心5min，取上清（棄沉淀）（2）上清中緩慢加入冷丙酮，使丙酮終體積分數(shù)達到50%(0.34體積），混勻后3000r/min離心15min，棄上清（3）沉淀中加入Tris-醋酸鎂緩沖液5ml，即為純化酶液。作為D液用于比活性測定。用于活性測定：用Tris-Mg(AC)2緩沖液將

A液稀釋25倍、B液稀釋10倍、C液稀釋5倍，D液不稀釋。用于含量測定：用Tris-Mg(AC)2緩沖液將

A液稀釋50倍、B液稀釋20倍、C液稀釋5倍，D液不稀釋。(二)堿性磷酸酶的活性測定實驗原理：

AKP是一種底物特異性較低，在堿性環(huán)境中能水解磷酸基團。最適pH范圍為8.8~10,需要鎂離子作為激活劑。血清AKP主要來自肝，小部分來自骨骼。

酶的活性通常是在一定條件下（最適溫度、最適的pH、必要的激動劑等），一定的時間內(nèi)，測定該酶所催化的反應系統(tǒng)中底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量來確定。磷酸苯二鈉磷酸鹽+酚AKP酚+4-氨基安替比林紅色醌類衍生物鐵氰化鉀管號空白標準ABCD酶液體0.10.10.10.1酚標準液0.1Tris-Mg(AC)20.1復合底物3.03.03.03.03.03.01.取試管6支編號（體積單位為ml）2.加入底物后,立即混勻,37℃準確15min后加入0.5%鐵氰化鉀2.0ml終止反應,混勻,靜置15min,510nm比色（大比色杯）AKP純化程度鑒定AKP純化程度用酶的比活性反映。酶的比活性是指單位濃度的酶蛋白樣品中的酶活性。BCA法測定AKP蛋白濃度BCA(bicinchoninicacid,二喹啉甲酸)Protein+Cu2+OH-Cu+BCA試劑紫色復合物(三)堿性磷酸酶的蛋白含量測定管號空白標準ABCD酶液體0.10.10.10.1蛋白標準液0.1Tris-Mg(AC)20.1BCA試劑

1.51.51.51.51.51.51.取試管6支編號（體積單位為ml）2.混勻后37℃水浴30min,562nm比色（小比色杯）管號空白標準ABCD酶液體0.10.10.10.1酚標準液0.1Tris-Mg(AC)20.1復合底物3.03.03.03.03.03.0管號空白標準ABCD酶液體0.10.10.10.1蛋白標準液0.1Tris-Mg(AC)20.1BCA試劑

1.51.51.51.51.51.51.取試管6支編號（體積單位為ml）酶活性測定2.取試管6支編號（體積單位為ml）酶蛋白含量測定管號空白標準ABCD酶液體0.10.10.10.1酚標準液0.1Tris-Mg(AC)20.1復合底物3.03.03.03.03.03.01.取試管6支編號（體積單位為ml）2.加入底物后,立即混勻,37℃準確15min后加入0.5%鐵氰化鉀2.0ml終止反應,混勻,靜置15min,510nm比色（大比色杯）722S型分光光度計使用方法開機預熱15min以上（打開蓋預熱）。轉(zhuǎn)動波長選擇鈕，選用所需的波長。將裝有空白、標準、樣品的比色杯放入比色杯架，使空白管對準光路。按MODE

鍵選擇trans模式。打開樣品室暗箱蓋（光門自動關(guān)閉），按0%ADJ

鍵，即能自動進行機械零點的調(diào)整，數(shù)碼顯示為0.000。蓋好比色杯暗箱蓋（光門自動開啟），按100%ADJ

鍵，即能自動進行空白零點的調(diào)整，數(shù)碼顯示為100.0。（一次如有誤差可再按一次）按MODE

鍵選擇吸光度測定模式（ABS燈亮），數(shù)碼顯示自動轉(zhuǎn)換為吸光度值0.000。拉動比色杯架的拉桿，使測定杯進入光路，從數(shù)碼顯示上即可讀出樣品的吸光度比色完畢后，關(guān)上電源開關(guān)，取出比色杯，將比色杯暗箱蓋好，清洗比色杯并晾干。分光光度計必須放置在固定而且不受振動的儀器臺上，不能隨意搬動，嚴防振動，潮濕和強光直射。分光光度計內(nèi)放有硅膠干燥袋，需定期更換。開機預熱15分鐘，待儀器穩(wěn)定以后再開始進行測定。每年需定期進行波長校準。必須保證測試樣品為澄清的溶液，肉眼看不出來的輕微濁度也能引起讀數(shù)的嚴重誤差，必要時可通過離心來去除微粒。檢測細菌培養(yǎng)液的光吸收時例外。從冰箱中取出的樣品一定要恢復到室溫后再進行檢測，否則低溫會使水蒸汽在比色皿表面凝結(jié)，引起讀數(shù)持續(xù)漂移上升。使用分光光度計的注意事項比色杯盛液量以達到杯容積2/3左右為宜。比色杯的外表面，則必須先用濾紙吸干，再用擦鏡紙或綢布擦凈，然后才能把比色杯放入比色杯槽內(nèi)。移動比色杯槽要輕，以防溶液濺出，腐蝕機件。不可用手拿比色杯的光學面，禁止用毛刷等物摩擦比色杯的光學面。用完比色杯后應立即用自來水沖洗，再用蒸餾水洗凈，也可用甲醇沖洗。洗滌后應把比色杯倒置晾干或用濾紙條將水吸去，再用擦鏡紙輕輕揩干。一定要保證比色皿正確放入光路后再進行測量。一般應把溶液濃度盡量控制在吸光度值0.2～0.7的范圍內(nèi)進行測定。這樣所測得的讀數(shù)誤差較小。如吸光度不在此范圍內(nèi)，可調(diào)節(jié)樣品溶液濃度，適當稀釋或加濃，使其在儀器準