分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用

分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用

分子生物學(xué)教研室

一.分子雜交與印跡技術(shù)Section1NucleicAcidBlottingandMolecularHybridization二.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的原理與應(yīng)用Section2PolymeraseChainReaction三.DNA序列測(cè)定Section3DNASequencingOutline2023/2/152第一節(jié).分子雜交與印跡技術(shù)2023/2/153（一）分子雜交（二）印跡技術(shù)（三）探針技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)的原理2023/2/154復(fù)習(xí)提問：什么是分子雜交？DNARNA具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈，在一定條件下，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則形成雙鏈的過程。RNADNA（一）.分子雜交2023/2/155復(fù)習(xí)提問：什么是DNA的變性與復(fù)性DNA變性：

變性條件：加熱、強(qiáng)堿和有機(jī)溶劑氫鍵斷裂，兩條單鏈分開磷酸二酯鍵不受影響，堿基排列順序不變HighpHLowsaltHightemperatureDNA變性是指核酸雙螺旋堿基對(duì)的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈。*2023/2/156DNA復(fù)性：當(dāng)去掉外界的變性因素，被解開的兩條單鏈又可重新互補(bǔ)結(jié)合，恢復(fù)成原來完整的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)分子。lowpHhighsaltlowtemperatureDNA的復(fù)性：互補(bǔ)單鏈通過堿基配對(duì)形成氫鍵2023/2/157什么是核酸分子雜交？（what

is

Nucleic

acid

molecular

hybridiaztion?）以DNA的變性與復(fù)性為理論基礎(chǔ)指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則經(jīng)過復(fù)性處理后，形成異源雙鏈的過程。*2023/2/158（二）.印跡技術(shù)印跡技術(shù)(blotting)：將各種生物大分子從凝膠轉(zhuǎn)移到一定固定基質(zhì)上的過程.生物大分子:DNARNA蛋白質(zhì)1975年，英國人Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。EdwinMellorSouthern埃德溫·邁勒·薩瑟恩2023/2/159

dry毛細(xì)管虹吸法Southern轉(zhuǎn)膜示意圖（1）毛細(xì)管虹吸法2023/2/1510

需要12-16h2023/2/1511

（2）電轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜裝置示意圖需要2-3h2023/2/1512探針的概念被標(biāo)記上可檢測(cè)信號(hào)的、已知序列的單鏈核酸片段

(RNA或DNA)探針是如何被標(biāo)記上的？什么是探針？（what

isprobe?）（三）.探針技術(shù)*2023/2/1513探針的標(biāo)記物（1）同位素標(biāo)記物：32P，35S，3H32P標(biāo)記dNTPDIG標(biāo)記dNTP（2）非同位素標(biāo)記物：生物素、地高辛、熒光素2023/2/15143’5’3’3’5’5’5’DNAPolIdNTPs+labled-dATPDNaseI3’3’5’5’5’3’ds-DNAtemplateMg2+DNA邊降解邊合成DNA合成時(shí)參入標(biāo)記的單核苷酸5’-3’聚合酶的活性5’-3’外切酶的活性缺口平移法探針的標(biāo)記方法DNAPolI延著5‘-3’方向切舊鏈，然后再合成新鏈2023/2/1515隨機(jī)引物法DNA合成時(shí)參入標(biāo)記的單核苷酸2023/2/15162.加入變性的探針DNA1.變性3.雜交4.檢測(cè)雜交體探針技術(shù)用一條已知的核酸序列，用這條核酸可以檢測(cè)出有沒有與其互補(bǔ)的堿基序列2023/2/1517利用核酸探針檢測(cè)DNA的核酸雜交稱作Southern印跡雜交利用核酸探針檢測(cè)RNA的核酸雜交稱作Northern印跡雜交Southern印跡雜交Northern印跡雜交斑點(diǎn)雜交原位分子雜交印跡雜交的類別及應(yīng)用DNA芯片Western印跡雜交利用抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)樣品中的某種蛋白質(zhì)的方法2023/2/1518Southern印跡雜交2023/2/15

1975年，英國人EdwinMellorSouthern創(chuàng)建①制備待測(cè)DNA樣品、標(biāo)記基因探針；②電泳分離待測(cè)DNA樣品；③待測(cè)DNA樣品的變性、轉(zhuǎn)膜；④雜交；⑤顯色。將電泳分離的待測(cè)基因組DNA酶切片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過程?；玖鞒倘缦拢?19EcoRI第一步：提取基因組DNA,用內(nèi)切酶消化的DNA片段并進(jìn)行電泳分離（1）DNA

isolation（2)

RE

Digestion（3）Agarose

gel

electrophoresis2023/2/1520TGAATCACATTG第二步：將凝膠電泳的DNA經(jīng)NaOH變性及中和后，轉(zhuǎn)移到合適的固相支持物上如硝酸纖維素膜（1）DNA

is

denatured

by

NaoH（2）Neutralize

(中和）2023/2/1521（3）TransferDNAtoMembrane（轉(zhuǎn)膜）2023/2/1522（1)Hybridization雜交

第三步：將標(biāo)記的探針與膜上的DNA進(jìn)行雜交2023/2/1523（2）Wash

(洗膜）2023/2/1524

第四步：利用放射自顯影或顯色的方法檢測(cè)目的DNA的存在放射自顯影的原理是利用放射性同位素所發(fā)射出來的帶電離子(α或β粒子)作用于感光材料的鹵化銀晶體，從而產(chǎn)生潛影，成為可見的像。2023/2/1525Southern印跡雜交過程小結(jié)印跡雜交2023/2/1526Southern印跡的應(yīng)用Southern印跡雜交在產(chǎn)前診斷、DNA圖譜分析及癌基因檢測(cè)等方面有重要價(jià)值。2023/2/1527DNA指紋圖譜（DNAfingerprinting）

1．高度的特異性：

基因多態(tài)性，每一個(gè)人所特有的。2．穩(wěn)定的遺傳性性：DNA指紋圖譜中幾乎每一條帶紋都來源于父母。3．體細(xì)胞穩(wěn)定性：

任何細(xì)胞中的的DNA指紋圖形完全一致。2023/2/1528Southernblot檢測(cè)DNA指紋基因具有多態(tài)性，每個(gè)個(gè)體酶切后的片段的長度不同，電泳后有不同的帶型。個(gè)體的核基因組的酶切片段：雜交短串聯(lián)重復(fù)序列（微衛(wèi)星DNA）：由2-6堿基對(duì)構(gòu)成核心序列

呈串聯(lián)重復(fù)排列

不同個(gè)體間存在有串聯(lián)數(shù)目的差異探針選擇：2023/2/1529結(jié)果用探針雜交后，每個(gè)人的雜交帶都是不一樣的。2023/2/1530

123樣本4567應(yīng)用：犯罪現(xiàn)場(chǎng)七個(gè)嫌疑人中那個(gè)是罪犯？2023/2/1531應(yīng)用：親子鑒定這兩個(gè)孩子那個(gè)是父親的親生孩子？2023/2/1532

將電泳分離的待測(cè)RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后與核酸探針雜交，進(jìn)而定性分析mRNA。基本程序：1、RNA的電泳2、轉(zhuǎn)膜:將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上3、雜交:膜上的RNA的與探針的雜交4、檢測(cè)雜交信號(hào)Northern印跡雜交可以檢測(cè)特定基因的表達(dá)豐度、樣式，2023/2/15332023/2/15與SouthernBlot極為相似Northern印跡特點(diǎn)檢測(cè)RNA電泳前無需酶切3電泳后無需變性34Northern印跡雜交已被RT-PCR方法取代（下節(jié)課講）Northern雜交的探針可以是DNA，也可以是RNA。Northern雜交可以相對(duì)定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的特定mRNA表達(dá)水平。2023/2/1535蛋白質(zhì)印跡雜交在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持物，然后用這種蛋白質(zhì)的特異抗體來檢測(cè)。2023/2/1536基本程序：1、電泳分離蛋白質(zhì)2、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜3、蛋白與抗體結(jié)合4、檢測(cè)抗體信號(hào)蛋白質(zhì)印跡雜交2023/2/1537

SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。

第一步：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳2023/2/1538

第二步：轉(zhuǎn)膜（電轉(zhuǎn)移）將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上或其他膜上。（只有電轉(zhuǎn)移方可實(shí)現(xiàn)）2023/2/1539

第三步：抗原抗體反應(yīng)蛋白質(zhì)的分析主要靠抗體來進(jìn)行。特異性抗體（稱為一抗：首先與膜上相應(yīng)的蛋白分子結(jié)合，然后于標(biāo)記的第二抗體結(jié)合。2023/2/1540化學(xué)顯色法:同位素法:化學(xué)發(fā)光法:熒光底物法：

第四步：顯示反應(yīng)2023/2/1541斑點(diǎn)雜交（DotBlot）將RNA或變性DNA樣品點(diǎn)到一張硝酸纖維素膜上，并將膜按區(qū)域劃分，點(diǎn)多個(gè)樣品，烘烤固定，然后與特定探針進(jìn)行雜交。優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速、可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品2023/2/1542突變雜合子鐮狀紅細(xì)胞貧血患者的基因診斷正常的（N）的ASO探針：

5′-ACTCCT

GAG

GAGAAGTCTGC-3′突變的（M）的ASO探針：

5′-ACTCCTGTG

GAGGAAGTCTGC-3′突變序列的探針正常序列的探針正常純合子突變純合子鐮狀紅細(xì)胞貧血是由珠蛋白的β基因發(fā)生單一堿基突變引起，正常β基因的第6位密碼子為GAG（編碼谷氨酸），突變后為GTG（編碼纈氨酸）2023/2/1543反向斑點(diǎn)雜交（reversedotblotting，RDB）2023/2/1544熒光原位分子雜交（FISH,FluorescenceInSituHybridization）

在保持細(xì)胞基本形態(tài)的情況下（不從組織或細(xì)胞中提取核酸），用探針在細(xì)胞的原位檢測(cè)靶DNA的存在情況--Chromosome+DNAprobe--LocatespecificgeneonChromosome2023/2/1545分子雜交的基本原理、“探針”。1.SouthernBlotting

（原理，過程，用途）2.NorthernBlotting

（過程，用途）4.insituhybridization（FISH）**3.DotBlotting（特點(diǎn)）小結(jié)3.WesternBlotting

（過程，用途）*2023/2/1546DNA芯片技術(shù)(Genechip)是指在固相支持物上直接將大量預(yù)先制備的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交。通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，得出樣品的遺傳信息。樣品被標(biāo)記熒光探針被固定到固相支持物上。高通量，自動(dòng)化*2023/2/1547正常組織異常組織對(duì)照組mRNA實(shí)照組mRNACy5標(biāo)記mRNACy3標(biāo)記mRNA等量混合激光掃描信息分析