第四章工業(yè)微生物育種誘變劑

第四章工業(yè)微生物育種誘變劑第一頁，共三十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)、物理誘變劑包括紫外線、X射線、r射線、快中子、微波、超聲波、電磁波、激光射線和宇宙線等。其中對微生物誘變效果較好,應(yīng)用較廣泛的是紫外線、X射線、r射線和快中子。物理輻射可分為電離輻射和非電離輻射。一、物理誘變劑的生物學(xué)效應(yīng)1、物理誘變劑對微生物的誘變作用主要是由高能輻射導(dǎo)致生物系統(tǒng)損傷，繼而發(fā)生遺傳變異的一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)過程。第二頁，共三十二頁，2022年，8月28日2、輻射引起的生物效應(yīng)，根據(jù)輻射種類和微生物種類不同有所差異。3、同一種輻射線對不同微生物的效應(yīng)不一樣，這與每種微生物修復(fù)系統(tǒng)的強(qiáng)弱有關(guān)。二、輻射引起生物效應(yīng)的影響因素1．微生物的遺傳背景：G+C%2．微生物的生理狀態(tài)3．可見光4．細(xì)胞水分5．溫度尤其對于電離輻射，較高溫度能促進(jìn)氧與自由基之間的相互作用、加速與DNA發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。在氧氣充足的條件下要比在缺氧條件下的電離輻射的生物學(xué)效應(yīng)顯著。第三頁，共三十二頁，2022年，8月28日三、非電離輻射——紫外線（一）紫外線的誘變機(jī)制和DNA損傷修復(fù)

1．紫外線的誘變機(jī)制有的是DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)．有的是胞嘧啶與尿嘧啶之間的水合作用，有的是DNA鏈的斷裂，還有的是形成嘧啶二聚體。形成嘧啶二聚體是產(chǎn)生突變的主要原因。

2．DNA損傷修復(fù)光復(fù)活切除修復(fù)第四頁，共三十二頁，2022年，8月28日（二）紫外線誘變1．紫外線有效光譜最有效的波長為253.7nm，而15w紫外燈管放射出來的紫外線大約有80％波長集中在253.7nm。

2．紫外線的輻射劑量分絕對劑量erg-1/mm2和相對劑量照射時間或者殺菌率表示。一般認(rèn)為殺菌率以90％-99.9％效果較好。但也有報道，認(rèn)為較低的殺菌率70—80%有利于正突變菌株的產(chǎn)生。第五頁，共三十二頁，2022年，8月28日（三）紫外線誘變的步驟與方法：（1）出發(fā)菌株細(xì)菌斜面培養(yǎng)到對數(shù)期，霉菌或放線菌則培養(yǎng)到孢子剛成熟。（2）前培養(yǎng)對細(xì)菌類以肉湯為主，適量加人核酸類物質(zhì)或酵母膏等制成營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，還可加人抑制修復(fù)的物質(zhì)，如咖啡堿或異煙肼等。（3）制備菌懸液

單細(xì)胞：細(xì)菌約108ml-1；放線菌約107～108ml-1，霉菌約106ml-1。（4）紫外線照射3-5ml，攪拌；避光，提前20min預(yù)熱紫外燈。結(jié)束時冰浴1-2h。第六頁，共三十二頁，2022年，8月28日（5）后培養(yǎng)冰浴后的菌懸液加人到適合于正突變體增殖的培養(yǎng)基中，在適宜溫度下培養(yǎng)1.5～2h。有些在增殖培養(yǎng)基中加人適量的酪素水解物、色氨酸或異煙肼等物質(zhì)，可以抑制修復(fù)，有利于突變體繁殖和減少細(xì)胞懸液在貯存過程中的死亡。第七頁，共三十二頁，2022年，8月28日3．電離輻射的照射方法菌懸液較好，不宜過多。照射后冰浴2-3h低溫可降低或抑制修復(fù)酶的活性。四、電離輻射1．常用于誘發(fā)突變：快中子、X射線線和r射線等。2．電離輻射劑量拉德（rad）也可以轉(zhuǎn)成倫琴（R）；不同種類菌種最適的劑量范圍不同；對不同的射線的敏感度也不同；不宜反復(fù)照射。殺菌率90％-99.9％為宜。第八頁，共三十二頁，2022年，8月28日五、近年的新型誘變劑1．微波2．紅外射線3．激光4．高能電子流5．離子注入第九頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑的劑量主要決定于其濃度和處理時間?；瘜W(xué)誘變劑都具毒性，其中90%以上是致癌物質(zhì)或極毒藥品，使用時要格外小心，不能直接用口吸，避免與皮膚直接接觸，不僅要注意自身安全，也要防上污染環(huán)境，造成公害?；瘜W(xué)誘變劑是一類能對DNA起作用、改變其結(jié)構(gòu)、并能引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。第十頁，共三十二頁，2022年，8月28日一、堿基類似物

用于誘發(fā)突變的堿基類似物有5-BU、5-FU、BUdr、5－IU等他們是胸腺嘧啶的結(jié)構(gòu)類似物，AP、6-MP是腺嘌呤的結(jié)構(gòu)類似物。最常用是5－BU和AP。

當(dāng)將這類物質(zhì)加人到培養(yǎng)基中，在繁殖過程中可以摻人到細(xì)菌DNA分子中，不影響DNA的復(fù)制。它們的誘變作用是取代核酸分子中堿基的位置，再通過DNA的復(fù)制，引起突變，因此，也叫摻人誘變劑。顯然這一類誘變劑要求微生物細(xì)胞必需處在代謝的旺盛期，才能獲得最佳的誘變效果。第十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日（一）堿基類似物的誘變機(jī)制

正常的堿基存在著同分異構(gòu)體，互變異構(gòu)現(xiàn)象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出現(xiàn)，而嘌呤分子中以氨基和亞氨基互為變構(gòu)的形式出現(xiàn)、一般互變異構(gòu)現(xiàn)象在堿基類似物中比正常DNA堿基中頻率更高。5-BU導(dǎo)致AT堿基對轉(zhuǎn)換為GC堿基

2-氨基嘌呤也可以誘發(fā)DNA分子中AT－GC或GC－AT的轉(zhuǎn)換。第十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日（二）堿基類似物的誘變處理方法（以5-BU為例）1．單獨(dú)處理

將微生物液體培養(yǎng)到對數(shù)期，離心除去培養(yǎng)液，加入生理鹽水或緩沖液，饑餓培養(yǎng)8-10h，消耗其體內(nèi)的貯存物質(zhì)，將5-BU加入到經(jīng)饑餓培養(yǎng)的培養(yǎng)液中，處理濃度為25-40ug／ml，混合均勻．取0.1-0.2ml菌懸液加人到瓊脂培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)。在適宜溫度下，使之在生長過程中誘變處理。培養(yǎng)后挑取單菌落，進(jìn)行篩選。如果是處理真菌、放線菌孢子，則要提高5-BU的濃度，常處理濃度為0.1mg／ml。第十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日2．與輻射線復(fù)合處理

據(jù)報道，如果菌體先用5-BU等堿基類似物進(jìn)行處理，使它們首先滲人到DNA分子中，然后用輻射線照射，誘變效果會比單獨(dú)使用射線要好。因此堿基類似物也是一種輻射誘變的增敏劑，從而提高突變率。第十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日二、烷化劑（一）烷化劑的作用機(jī)制

烷化劑分單功能烷化劑和雙功能或多功能烷化劑兩大類。前者僅一個烷化基團(tuán)，對生物毒性小，誘變效應(yīng)大。后者具有兩個或多個烷化基團(tuán)，毒性大，致死率高，誘變效應(yīng)較差。主要原因是雙功能烷化劑有硫芥、氮芥。第十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日

烷化劑主要是通過烷化基團(tuán)使DNA分子上的堿基及磷酸部分烷化，DNA復(fù)制時導(dǎo)致堿基配對錯誤而引起突變，堿基中容易發(fā)生烷化作用的是嘌呤類。其中鳥嘌呤N7是最易起反應(yīng)的位點(diǎn)，幾乎可以和所有烷化劑起烷化作用；此外，DNA分子中比較多的烷化位點(diǎn)是鳥嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，這些可能都是引起突變的主要位點(diǎn)。其次引起烷化的位點(diǎn)是鳥嘌呤N3、腺嘌呤N2，腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。這些位點(diǎn)引起堿基置換的僅占烷化作用的10％左右。因此，由這些位點(diǎn)改變所引起的突變僅是少數(shù)。烷化劑也能造成磷酸和核糖之間的共價鍵斷裂，而造成突變。第十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日（二）烷化劑的性質(zhì)

溶液烷化劑的性質(zhì)比較活潑，不太穩(wěn)定，在水溶液中容易發(fā)生分解。它們大部分半衰期很短，其長短與溫度、溶液PH關(guān)系很大。因此，化學(xué)誘變劑要現(xiàn)用現(xiàn)配還要避光。配制烷化劑時，要采用合適的緩沖液。有毒！！??！第十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日（三）常用的烷化劑1、亞硝基胍（NTG）黃色晶體物質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定，容易光解，黃色變?yōu)榫G色時，誘變效應(yīng)際低。有超誘變劑之稱，常用緩沖溶液有磷酸緩沖液和Tri緩沖液。第十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日

誘變處理方法：①用一定值的磷酸緩沖液或Tri緩沖液洗制成菌懸液。②NTG母液：配制需加助溶劑甲酰胺或丙酮少許，然后加緩沖液，其比例為緩沖液9ml：NTG丙酮溶液lml，濃度為NTG1mg/ml；使用時取母液0.2ml+菌懸液1.8ml，NTG終濃度為100ug/ml。一般隨菌種不同而異，細(xì)菌一般為100-1000ug/ml，放線菌、真菌為l000-3000ug/ml。③放線菌在生長適宜的溫度下培養(yǎng)，（細(xì)菌30-35℃、真菌25-28℃、放線菌30-32℃）處理若干時間，一般細(xì)菌20-60min,孢子90-120min④終止反應(yīng)。冷的生理鹽水50倍稀釋處理，或經(jīng)過離心洗滌處理，作一定稀釋度分離于平皿。如果是細(xì)菌，把培養(yǎng)基按一定濃度加入到菌體沉淀物中，振蕩培養(yǎng)1.5-2h，經(jīng)2-3次細(xì)胞分裂，再涂平皿。第十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日處理完畢后，馬上把接觸過NTG的器皿用NaOH浸泡處理。NTG除以上直接以溶液處理外，還可以按以下方法誘變處理，搖瓶振蕩處理：在接菌后的培養(yǎng)基中加人5-10ug/mlNTG．并加幾滴吐溫60或吐溫80，使成乳化狀（注意吐溫對該菌生長是否有影響）；在平皿上生長過程處理：如果將NTG、瓊脂和菌體混合制成平板，NTG濃度為10-50ug/ml?；?qū)傊囵B(yǎng)基制成平板．然后將NTG和菌體混合涂抹平板，此時NTG濃度為10-20ug/ml。第二十頁，共三十二頁，2022年，8月28日

經(jīng)后培養(yǎng)的培養(yǎng)液．除部分進(jìn)行平皿分離外。剩余的培養(yǎng)液可以加人適量的藥物，保存于冰箱內(nèi)數(shù)天。如日本有人把經(jīng)過NTG處理后的大腸桿菌培養(yǎng)液，用50％甘油（最終濃度為12.5％）于-40℃、-80℃保存。在以后數(shù)天內(nèi)隨時可取出融化，稀釋分離，突變體死亡很少。據(jù)報道，無論是用輻射處理，還是用化學(xué)誘變劑處理后的菌懸液或培養(yǎng)液，浸在冰浴中2-3h，試驗(yàn)的重復(fù)性很好。認(rèn)為在大腸桿菌、枯草桿菌和放線菌等可以采取這一措施來提高誘變效果。NTG是一種強(qiáng)烈致癌物質(zhì)，操作時要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。凡接觸過NTG的器皿必須及時、單獨(dú)處理，利用自來水大量沖洗或用1-2N的NaOH浸泡過夜，洗凈。第二十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日2．甲基磺酸乙酯（簡稱EMS）甲基磺酸乙酯是磺酸酯類中誘變效果較好的一種烷基化合物，外觀呈粉末狀或無色液體，難溶于水，不穩(wěn)定，易水解成無活性物質(zhì)。EMS的誘變處理方法：①EMS母液的配制：為了安全和防上失效，配制前將需用的器皿，置冰箱內(nèi)預(yù)冷，然后在冰浴中進(jìn)行配制。取0.5mlEMS原液，加人到10mlpH7.2磷酸緩沖液中，加蓋，并輕輕轉(zhuǎn)動試管。由于在水溶液中易失效，故盡可能低溫保藏，并要現(xiàn)用現(xiàn)配。第二十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日②取新鮮的菌體，經(jīng)前培養(yǎng)至對數(shù)期．離心洗滌，用緩沖液制成8ml菌懸液（107-108ml-1）。對于絲狀菌孢子，則前培養(yǎng)至萌動期，懸液含106ml-1。③取EMS母液2ml，加人到以8ml的菌懸液中。在適宜溫度下處理一定時間（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)mol／L。④EMS處理一定時間后，用50倍生理鹽水稀釋或加入一定量的2%NaS2O3溶液或多次離心、洗滌，以終止反應(yīng)。EMS是劇毒的誘變劑，在整個誘變過程，包括配制藥品、操作處理、保存等都要嚴(yán)守安全，不能接觸皮膚，所有接觸過EMS的器皿，單獨(dú)用大量水沖洗洗滌，或用10％NaS2O3溶液浸泡過夜，再用清水沖洗干凈。第二十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日三、脫氨劑亞硝酸是一稀常用的誘變劑，毒性小．不穩(wěn)定，易揮發(fā)．其鈉鹽易在酸性緩沖液中產(chǎn)生NO和NO2（一）亞硝酸的誘變機(jī)制脫去堿基中的氨基變成酮基，引起轉(zhuǎn)換而發(fā)生變異。A→H，C→U，G→X。A：T→G：C和G：C→A：T。亞硝酸的誘變也可以發(fā)坐回復(fù)突變。亞硝酸除了脫氨基作用外，還可引起DNA交聯(lián)作用，DNA復(fù)制，從而導(dǎo)致奕變。第二十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日（二）亞硝酸的處理方法1．試劑的配制（1）1mol／LpH4.5醋酸緩沖液（2）0.1mol／L亞硝酸鈉溶液（3）0.07mol／LpH8.6磷酸氫二鈉溶液以上試劑用前均要滅菌。第二十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日2．處理方法

取孢子懸液1ml，pH4.5醋酸緩沖液2ml及硝酸鈉溶液lml，最后處理濃度為0.025mol／L；25-26℃保溫10-20min，加入的磷酸氫二鈉溶液20ml，使pH下降至pH6.8左右，以終止反應(yīng)。稀釋分離于平板。如果是處理細(xì)菌，亞硝酸最后濃度以0.05mol／L。在亞硝酸處理菌體或孢子時要嚴(yán)格控制好溫度，否則會影響誘變效果。第二十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日四、移碼誘變劑移碼誘變劑與DNA相互結(jié)合引起堿基增添或缺失而造成突變。它們主要包括吖啶黃、吖啶橙、ICR－171、ICR-191等。移碼誘變劑對噬菌體有強(qiáng)烈的誘變作用，誘發(fā)細(xì)菌、放線菌的質(zhì)粒脫落比其他誘變劑效果更為顯著。如某些產(chǎn)生抗生素的放線菌。用處理后，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量明顯下降，主要就是由于控制抗生素合成的質(zhì)粒脫落造成的。第二十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日吖啶黃的性質(zhì)和使用方法：淡黃色晶體，微溶于熱水，溶于乙醇和乙醚，不穩(wěn)定，見光易分解。使用時，先用少許乙醇溶解，配成一定濃度的母液。通常處理方法是特將它們加入培養(yǎng)基中，使最后濃度為10-50ug/ml，混合后制成平板，適溫培養(yǎng)，在生長過程中處理。另外還可將吖啶黃加人到培養(yǎng)液中，濃度為10-20ug/ml，在適溫條件下，振蕩培養(yǎng)過程中處理。第二十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日五、羥化劑【以羥胺為例】羥胺的簡稱HA，常以鹽酸羥胺形式存在，為白色晶體，溶于水，不穩(wěn)定易分解，具腐蝕性。1.羥胺的誘變機(jī)制當(dāng)羥胺濃度為0.1-1.0mol／LpH6.0時，主要與胞嘧啶反應(yīng)，使羥化的C與A配對，在0.1-1.0mol／LpH9.0，羥胺可以與鳥嘧啶反應(yīng)，10-3mol／L時，羥胺可以與胸腺嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶