新城疫病毒誘導(dǎo)雞胸腺法氏囊細(xì)胞凋亡的初步研究img,alt,stylemargin

本文格式為Word版，下載可任意編輯——新城疫病毒誘導(dǎo)雞胸腺法氏囊細(xì)胞凋亡的初步研究,,img,alt,stylemargin新城疫病毒誘導(dǎo)雞胸腺、法氏囊細(xì)胞凋亡的初步研究李翔房慧伶曾蕓廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院廣西南寧530005摘要新城疫NewcastleDisease,胭是由副粘病毒科新城疫病毒NewcastleDisaasVirus,胭r引起的烈性傳染桂疾病。最近研究說明，NDV可在體外謗導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，但NDV在體內(nèi)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡尚未見報(bào)道．本研究用新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E株感染雞，通過光鏡和電鏡查看雞的胸腺和法氏囊中淋巴細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征并在光鏡下計(jì)數(shù)和舉行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析．光鏡下，對照組胸膝爭法氏囊凋亡淋巴細(xì)胞數(shù)量較少；

感染蛆脾腺和琺氏囊琳巴細(xì)胞展現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡．無論是對照組還是感染組，凋亡細(xì)胞的數(shù)量在皮質(zhì)多于髓質(zhì)，而且在皮質(zhì)與越質(zhì)交界處最多．電鏡下可以領(lǐng)會地查看到細(xì)胞凋亡過程和多種形態(tài)的凋亡細(xì)胞及凋亡小律的形成與除掉．意肇后期，在腳腺和法氏囊組織中察覺有細(xì)胞變柱，壞死．胸腺和法氏囊淋巴細(xì)胞平均凋亡率變化曲線圖顯示胸腺和法氏囊淋巴細(xì)胞的凋亡率變化規(guī)律的一樣的．1感染組的凋亡率顯著高于對照組；

2對照蛆凋亡率隨著天數(shù)的增加而增大3感染組的凋亡率隨著天數(shù)的增加而增大，并于第三天達(dá)成最大．以后逐步回落．統(tǒng)計(jì)舉分析說明胸腺和法氏囊淋巴細(xì)胞的凋亡率感染姐與對照蛆對比呈楓顯著差異p0．01。

測驗(yàn)姑果說明NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F45B人I感皋嗚后可以請導(dǎo)胸朦和法氏囊淋巴細(xì)胞凋亡，同時(shí)引起雞胸腺和法氏囊淋巴細(xì)胞壞曩，造成淋巴細(xì)胞數(shù)量裁減，導(dǎo)致免疫抑制．關(guān)鍵詞t斷城疲病毒胸朦法氏囊細(xì)胞凋亡新城痰Newcast]eD1sesse,刀是由副牯病毒科新城疫病毒Newcast]eDiseaseVirus,徹n引起的烈性傳染性疾病。NDV能夠引起胸腺和法氏囊淋巴細(xì)胞大量壞死，導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制。對NDv引起ND的病理學(xué)入們已經(jīng)作過較細(xì)致的研究，但對NDV引起胸腺和法氏囊淋巴細(xì)胞凋亡的研究較少。最近研究說明，NDV可在體外誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，使淋巴細(xì)胞數(shù)量裁減，導(dǎo)致免疫抑制，但NDV在體內(nèi)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過對人工感染NDV的雞脾腺和法氏囊舉行光鏡和電鏡查看，直接查看至0胸腺和法氏囊淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型特征．為表明NDV引起免疫抑制的機(jī)理供給了直接證據(jù)。

1，材料和方法1．1材料1．1．1雞北海風(fēng)翔畜禽有限公司供給。30只，品種中麻雞。

L1．2NDV毒株F48F．8株，廣西大學(xué)動科院禽病研究室供給。

1．2方法1．2．1檢測母源抗體血清學(xué)試驗(yàn)，呈陰性。

．124i．2．2測驗(yàn)雞分組，攻毒，飼養(yǎng)測驗(yàn)雞隨即分為兩組感染組和對照組，每組15只，隔離飼養(yǎng)。25日齡攻毒將新城疫標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E8舉行l(wèi)10稀釋，每只雞肌肉注射0．5ml。

1．2．3取材攻毒后ld，2d，3d，4d，5d連續(xù)取材。每天剖殺6只，對照組和感染紐各3只。取雞的肝，脾，胸腺，法氏囊舉行姐清學(xué)試驗(yàn)。取雞的胸腺和法氏囊舉行如下固定】光鏡查看的材料用lo％的福爾馬林溶液固定。

2電鏡查看的材料用3％的戊二醛固定。

l2。4新城疫病毒的檢測血清學(xué)試驗(yàn)，呈陽性。

1．2．5光鏡制樣，查看常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡查看，拍照。

1．2．6電鏡制樣，查看1％鋨酸固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡查看，拍照。

1．2．7凋亡指數(shù)％的計(jì)算光學(xué)顯微鏡下查看，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，并計(jì)算凋亡指數(shù)。

凋亡指數(shù)％該范圍內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)／該范圍細(xì)胞總數(shù)*100％2．結(jié)果2．1光鏡查看對照組胸腺和法氏囊凋亡淋巴細(xì)胞數(shù)量較少；

感染組胸腺和法氏囊淋巴細(xì)胞展現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡。無論是對照組還是感染組，凋亡細(xì)胞的數(shù)量在皮質(zhì)多于髓質(zhì)，而且在皮質(zhì)與髓質(zhì)交界處最多。凋亡早期的淋巴細(xì)胞嗜堿性鞏固，體積縮小，胞漿濃縮，并與周邊淋巴細(xì)胞脫離。隨后細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，邊集，裂解成致密的球形染色質(zhì)團(tuán)塊凋亡小體，結(jié)果被巨噬細(xì)胞吞噬。感染后期，在胸腺和法氏囊組織中察覺有細(xì)胞變性、壞死。

2．2電鏡查看在電鏡下可以領(lǐng)會地查看到了細(xì)胞凋亡過程及形成的凋亡小體。由于在同一組織中細(xì)胞凋亡并不是同時(shí)發(fā)生的，所以處在不同凋亡階段的凋亡細(xì)胞均可見到。細(xì)胞凋亡早期，染色質(zhì)濃縮，邊集，核膜和胞膜完整，線粒體，高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器無明顯變化，但數(shù)量裁減。細(xì)胞凋亡中期，細(xì)胞變形，細(xì)胞膜仍完整。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核展現(xiàn)各種各樣的形態(tài)新月形、半月形、“c”形、花瓣?duì)?、圓環(huán)狀或圓斑狀等。后期細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞膜出泡，芽生形成膜包裹的凋亡小體。凋亡小體常包含濃染的染色質(zhì)團(tuán)塊及片面胞漿成分。最后凋亡細(xì)胞和凋亡小體被巨噬細(xì)胞吞噬、除掉。個(gè)別凋亡細(xì)胞的細(xì)胞器和胞漿內(nèi)展現(xiàn)空泡，還有些凋亡細(xì)胞發(fā)生繼發(fā)性壞死。

．125．2．3統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算凋亡率，繪制曲線圖2．3．1對胸腺和法氏囊凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)舉行統(tǒng)計(jì)分析。

表1胸腺淋巴細(xì)胞平均凋亡率％Groupld2d3d4d5dControl0．169-士0．10l0．246士0．0710．408士0．1850．462士0．1660．685t0．147TreatmenI1．139-0．2681．315￡-0．3003．8390．2523．339-I-0．3562．915士O．559PpO．OlpO．Olp0．01p0．01D0．01表2法氏囊淋巴細(xì)胞平均凋亡率％Group1d2d3d4d5dContr011．23士0．2631．61￡-0．2862．26t0．3072．6l士o．4322．80士o．477Treatment2．03i-0．3423．8IL-0．6324．64t0．5924．13t9．8123．73士-0．499Pp0．01p0．01p0．01pO．01pO．01從表1、表2可以看出，胸腺和法氏囊淋巴細(xì)胞的凋亡率感染組與對照組對比呈極顯著差異pO．01。感染后第三天細(xì)胞凋亡率達(dá)成最高。對照組凋亡率隨著天數(shù)的增加而增大。法氏囊無論是對照組還是感染組，其淋巴細(xì)胞的平均凋亡率都高于胸腺。

2．3．2凋亡率及其曲線圖．126．圖1胸腺淋巴緬胞平均凋亡率變化曲線圖圖2法氏囊淋巴細(xì)胞平均凋亡率變化曲線圖從瞌線圈可以看出胸腺和法氏囊淋巴細(xì)胞的凋亡率變化規(guī)律的一樣的。

1感染組的凋亡率顯著高于對照組；

2對照組凋亡率隨著天數(shù)的增加而增大；

3感染組的凋亡率隨著天數(shù)的增加而增大，并于第三天達(dá)成最大，以后逐步回落。

3．議論3．1測驗(yàn)結(jié)果說明，對照組和感染組的胸腺和法氏囊的淋巴細(xì)胞都發(fā)生了細(xì)胞凋亡。胸腺和法氏囊的皮質(zhì)和髓質(zhì)，在光鏡下可以查看到染色質(zhì)凝集形成的圓形，半月形等外形的凋亡細(xì)胞及細(xì)胞核裂解形成的凋亡小體；

在電鏡下除查看到多種外形的凋亡細(xì)胞外，還可以查看到凋亡小體的形成和消亡過程細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)電子密度增大一染色質(zhì)凝集并裂解為數(shù)個(gè)圓形團(tuán)塊，然后散開一細(xì)胞膜內(nèi)陷，逐步將含有致密染色體團(tuán)塊和片面胞漿的凋亡小體釋放出去，結(jié)果被巨噬細(xì)胞吞噬。光鏡與電鏡查看結(jié)果～致，從不同角度顯示了胸腺和法氏囊的淋巴細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化過程。

3．2NDV能在體內(nèi)同時(shí)引起雞胸腺，法氏囊淋巴細(xì)胞壞死和凋亡。這與LamKM報(bào)道的雞新城疫病毒感染在導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的同時(shí)又伴隨著細(xì)胞壞死的結(jié)果是一致的?。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死是細(xì)胞死亡的兩種不同形式，兩者的超微布局變化明顯不同細(xì)胞發(fā)生壞死時(shí)，細(xì)胞器的變化早于細(xì)胞核的交化，細(xì)胞胞質(zhì)腫脹，細(xì)胞體積增大，胞膜破損，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張；

當(dāng)細(xì)胞核壞死時(shí)，染色質(zhì)嗜堿性減弱，呈稀疏細(xì)顆粒狀，分布無規(guī)律，邊界不清；

細(xì)胞急速展現(xiàn)腫脹和溶解。而細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞皺縮，胞膜完整，胞漿內(nèi)的細(xì)胞器變化發(fā)生較遲且變化不明顯，細(xì)胞核染色質(zhì)早期即發(fā)生凝集、邊集、嗜堿性鞏固、細(xì)胞核固縮、碎裂成數(shù)個(gè)圓形顆粒。

3．3凋亡細(xì)胞的數(shù)量，在皮質(zhì)多于髓質(zhì)，而且在皮質(zhì)和髓質(zhì)的交界處凋亡細(xì)胞的數(shù)量最多。這是由于皮質(zhì)和皮髓交界處為淋巴細(xì)胞舉行陽性選擇和陰性選擇的部位”1，所以在皮質(zhì)或皮髓交界處展現(xiàn)細(xì)胞凋亡的幾率就大一些。未成熟的淋巴細(xì)胞是～種雙陽性細(xì)胞，即．127CD4--CDa雙陽性細(xì)胞，與胸腺上皮細(xì)胞的姍IC分子相互作用，發(fā)育成單陽性細(xì)胞，這一過程為淋巴細(xì)胞的陽性選擇。未成熟的淋巴細(xì)胞與自身憫c分子和自身抗原共同作用，啟動細(xì)胞凋亡程序，導(dǎo)致細(xì)胞被除掉，此過程即為陰性選擇。淋巴細(xì)胞的陽性選擇，導(dǎo)致了CD4域Cm細(xì)胞的展現(xiàn)和正常發(fā)育，而陰性選擇導(dǎo)致了凋亡”1。李玉谷、辛朝安等，通過對鴨胸腺細(xì)胞自然凋亡的電鏡查看，察覺鴨自然凋亡的胸腺細(xì)胞多位于胸腺皮質(zhì)“’，這與本測驗(yàn)結(jié)果好像。

3．4從胸腺、法氏囊的淋巴細(xì)胞平均凋亡率變化曲線圖可以看出，人工感染新城疫病毒后的第三天，感染組的細(xì)胞凋亡率達(dá)U最大值，以后逐步回落，這可能與NDv誘導(dǎo)的時(shí)間有緊密關(guān)系。劉勝旺、陳洪巖等，在新城痰F48E9病毒體外誘導(dǎo)雞T細(xì)胞程序性死亡的試驗(yàn)中，用流式細(xì)胞儀檢測，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，凋亡細(xì)胞的數(shù)目也明顯增加“3。以后逐漸回落可能與細(xì)胞壞死有關(guān)。病毒感染除了能引起細(xì)胞凋亡，還引起細(xì)胞壞死。細(xì)胞凋亡是病毒損傷細(xì)胞的最直接機(jī)制，而有些細(xì)胞為了抗?fàn)幉《菊T導(dǎo)的凋亡而以壞死形式發(fā)生死亡，因而在病毒感染的早期，壞死細(xì)胞不多見，但隨著病程的延長，細(xì)胞壞死的程度也隨之增加”1。

陳志勝、王丙云、潘患雄等，通過對鴨肝炎病毒誘導(dǎo)雛鴨細(xì)胞凋亡的研究。察覺DttV強(qiáng)毒株在接種后24h即可誘導(dǎo)免疫器官有明顯的細(xì)胞凋亡，而接種后72h凋亡處境逐步?！旧?。脾、胸膿、法氏囊凋亡率在36h達(dá)顛峰。然后逐步被壞死代替，透露了雛鴨發(fā)病過程中，免疫細(xì)胞的凋亡先于病理性損傷發(fā)生。DIN可誘導(dǎo)胸腺、法氏囊細(xì)胞及脾臟胸腺憑借及非憑借區(qū)淋巴細(xì)胞均發(fā)生