生物化學(xué)-第三十五章 DNA的重組與基因工程

生物化學(xué)-第三十五章DNA的重組與基因工程Chapter35DNA的重組與基因工程基因重組與基因工程？Geneticrecombination

Chapter35DNA的重組與基因工程一、DNA的重組的分類(lèi)同源重組、特異位點(diǎn)重組和轉(zhuǎn)座重組等類(lèi)型二、自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組是無(wú)目的基因工程有目的基因重組(geneticrecombination)——整段DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間,甚至不同物種間進(jìn)行交換,并能在新的位置上復(fù)制,轉(zhuǎn)錄和翻譯。

Chapter35DNA的重組與基因工程二、自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組1、結(jié)合作用結(jié)合作用——質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）2、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（1）轉(zhuǎn)化作用transformation通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型的過(guò)程（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用transduction病毒、噬菌體介導(dǎo)溶菌途徑溶原菌途徑3、轉(zhuǎn)座（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用transduction病毒、噬菌體介導(dǎo)溶菌途徑溶原菌途徑2、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)導(dǎo)作用3、轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座

反向重復(fù)序列由可移動(dòng)的DNA序列（插入序列和轉(zhuǎn)座子）介導(dǎo)的基因移位或重排①插入序列轉(zhuǎn)座保守性轉(zhuǎn)座復(fù)制性轉(zhuǎn)座反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶②轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子—可以從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移至另一位點(diǎn)的分散的重復(fù)序列

Chapter35DNA的重組與基因工程二、自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組4、基因重組不同DNA分子間發(fā)生的共價(jià)連接稱(chēng)重組（一）位點(diǎn)特異的重組特異位點(diǎn)（二）同源重組同源序列間的重組

Chapter35DNA的重組與基因工程三、重組DNA技術(shù)1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物1982第一個(gè)基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國(guó)轉(zhuǎn)基因魚(yú)1993基因工程西紅柿在美國(guó)上市1997英國(guó)羅斯林研究所多莉羊1999.9中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類(lèi)基因組計(jì)劃.負(fù)責(zé)測(cè)定人類(lèi)基因組全部序列的1%2000.6.26科學(xué)家公布人類(lèi)基因組工作草圖公布人類(lèi)基因組基本信息生物技術(shù)工程：基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程

Chapter35DNA的重組與基因工程三、重組DNA技術(shù)胰島素人生長(zhǎng)激素干擾素白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長(zhǎng)激素促生長(zhǎng)素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體

Chapter35DNA的重組與基因工程三、重組DNA技術(shù)（一）重組DNA技術(shù)的相關(guān)概念1、DNA克隆克隆（clone）無(wú)性繁殖分子克隆(DNA克隆)—應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（復(fù)制子、重組體），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子拷貝，或其表達(dá)產(chǎn)物。基因克隆、DNA重組、基因工程(geneticengineering)基因克隆示意圖

2、工具酶常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基（一）重組DNA技術(shù)的相關(guān)概念限制性核酸內(nèi)切酶細(xì)菌限制修飾體系

限制性核酸內(nèi)切酶甲基化酶識(shí)別特異的位點(diǎn)—酶切位點(diǎn)回文結(jié)構(gòu)4～6bp出現(xiàn)兩種末端粘性末端粘端平頭末端平端配伍末端（一）重組DNA技術(shù)的相關(guān)概念目的基因（外源基因）cDNA逆轉(zhuǎn)錄基因組DNA基因工程的目的目的基因拷貝克隆載體基因表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)載體3、目的基因targetDNA（一）重組DNA技術(shù)的相關(guān)概念自我復(fù)制克隆載體、表達(dá)載體原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC…）噬菌體（λ，M13）真核載體：動(dòng)物病毒載體pLXSN質(zhì)?！嬖谟诩?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子理想的質(zhì)粒1.拷貝數(shù)多;2.兩三個(gè)抗藥性基因terrr篩選標(biāo)志3.合適的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)（單一）（一）重組DNA技術(shù)的相關(guān)概念4、基因載體vector

Chapter35DNA的重組與基因工程三、重組DNA技術(shù)基本原理（一）目的基因獲得1、化學(xué)合成法2、基因組DNA基因組DNA文庫(kù)—存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌中、克隆載體攜帶的所有基因組DNA的集合3、cDNAcDNA文庫(kù)4、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR(二)克隆載體的選擇和構(gòu)建(三)外源基因與載體的連接（DNA連接酶）連接方式1.粘性末端連接連接效率高相同酶切末端配伍末端2.平端連接連接效率低3.同聚物接尾法4.人工接頭法

Chapter35DNA的重組與基因工程三、重組DNA技術(shù)基本原理重組DNA技術(shù)簡(jiǎn)圖(四)重組DNA導(dǎo)入受體菌基因工程菌HB101,JM109轉(zhuǎn)化制備感受態(tài)細(xì)胞冷的氯化鈣處理細(xì)胞處于最適攝取和容忍外來(lái)DNA的生理狀態(tài)

Chapter35DNA的重組與基因工程三、重組DNA技術(shù)基本原理(五)重組體的篩選screening/selection1.直接選擇法抗藥性標(biāo)志選擇標(biāo)志補(bǔ)救表達(dá)產(chǎn)物與營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)α—互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選分子雜交探針原位雜交/Southern印跡法限制性酶切圖譜/PCR2.非直接選擇法免疫學(xué)方法

Chapter35DNA的重組與基因工程三、重組DNA技術(shù)基本原理(六)克隆基因的表達(dá)載體有轉(zhuǎn)錄、翻譯的元件密碼子通用1、原核表達(dá)體系原核表達(dá)載體的標(biāo)準(zhǔn)合適的篩選標(biāo)志強(qiáng)啟動(dòng)子翻譯控制序列多克隆位點(diǎn)

Chapter35DNA的重組與基因工程三、重組DNA技術(shù)基本原理

Chapter35DNA的重組與基因工程四、重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系分子醫(yī)學(xué)molecularmedicine（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)（二）發(fā)展生物制藥基因工程藥物基因工程疫苗（三）DNA診斷基因診斷基因診斷—用分子生物學(xué)的技術(shù)對(duì)引起疾病的原因--遺傳基因,致病微生物和寄生蟲(chóng),以及某些惡性腫瘤在基因水平上進(jìn)行病原學(xué)和細(xì)胞遺傳基因的檢測(cè)和分析.DNA/RNA

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