分子實(shí)驗(yàn)手冊

RNA提取試驗(yàn)原理在全部RNARNA〔RNA酶〕的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反響不需要關(guān)心因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在試驗(yàn)中，一方面要嚴(yán)格掌握外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學(xué)試驗(yàn)中使用的RNA酶也會(huì)造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、爭論人員的手及各種試劑。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶。①防止RNA酶污染的措施1806hR或更長時(shí)間。0.1%DEPC〔。有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇枯燥，再浸泡在3%HO10min，2 20.1%DEPC水沖洗，晾干。0.1%DEPC3712h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，試驗(yàn)過程中手套要勤換。設(shè)置RNA操作專用試驗(yàn)室，全部器械等應(yīng)為專用。②常用的RNA酶抑制劑焦磷酸二乙酯DEPC：是一種猛烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。RNARNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞構(gòu)造使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有猛烈的變性作用。氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑RNasiRNasin是RNA一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有肯定抑制作用。試驗(yàn)材料擬莖點(diǎn)霉菌體、研缽、錫箔紙、液氮、藥匙、RNase-free耗材〔1.5ml離心管、槍頭、離心機(jī)、柱式真菌RNA提取試劑盒、無水乙醇試驗(yàn)步驟試驗(yàn)預(yù)備1804h。②柱式真菌RNAGTSolutionNTSolution中參加相應(yīng)量的無水乙醇，混勻后在瓶身做好標(biāo)記。于室溫密封保存。每次使用后將瓶蓋蓋緊，以保持GTSolution、NTSolution中的乙醇含量。450μlBuffeRRlysis-FG1.5mlRNase-free的離心管中備用20mg枯燥的菌絲用液氮研磨成粉末1.5ml5min。留意留意應(yīng)快速參加裂解液中震蕩混勻，避開RNA留意管的爆裂，請留意安全。4.12,000rpm4°C3min1.5mlRNase-free的離心管中。1/2體積無水乙醇，充分混勻。留意留意3：即使消滅沉淀也不要離心。將吸附柱放入收集管中1mi12,000rpm離心1倒掉收集管中廢液。4：GTSolution使用前請檢查是否按比例參加無水乙醇。將吸附柱放回收集管中，參加500μlGTSolution，靜置1min，室溫10,000rpm14：GTSolution使用前請檢查是否按比例參加無水乙醇。500μlNTSolution1min10,000rpm1min，倒掉收集管中廢液。將吸附柱放回收集管中，室溫12,000rpm2min。留意留意5：此步絕不行省略，否則剩余的乙醇會(huì)嚴(yán)峻影響得率和后續(xù)試驗(yàn)。留意RNA將吸附柱放入RNase-free1.5ml30~50μlDEPC-treatedddH2O，靜2min，12,000rpm2min，將所得到的RNA溶液置于-80°C保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。二、RT-PCR試驗(yàn)原理逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反響(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNmRNAOlig〔d或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDN。cDNA為模板進(jìn)展PCRRT-PCRRNA檢測的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獵取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。試驗(yàn)材料RNA、第一鏈cDNA合成試劑盒、ddHO、PCR管、PCR儀2試驗(yàn)步驟1.組分混合組分TotalRNAAnchoredOligo(dT)18Primer(0.5μg/μl)2xESReactionMixEasyScript?RT/RIEnzymeMixgDNARemoverRNase-freeWaterTotalvolume2.4230min，855s。

體積50-5000ng1μl10μl1μl1μlVariable20μl三、目的基因擴(kuò)增試驗(yàn)原理聚合酶鏈反響(PolymeraseChainReaction，PCR)80年月中期進(jìn)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要爭論的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀看和推斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析爭論和檢測鑒定。類似于DNAPCR由變性--退火--延長三個(gè)根本反響步驟構(gòu)成：①模板DNADNA93DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反響作預(yù)備；DNA與引物的退火(復(fù)性)DNA55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延長：DNA模板--TaqDNAdNTP為反響原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保存復(fù)制原理，合成一條的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保存復(fù)制鏈。退火2～～3(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。試驗(yàn)材料高保真擴(kuò)增酶Mix、ddH2O、50XTAEPCR儀試驗(yàn)步驟組分混合組分組分cDNA2×PhantaMaxMasterMix上游引物(10μM)下游引物(10μM)ddH2O體積〔25μl〕3μl12.5μl1μl1μl7.5μlPCR反響程序循環(huán)步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)預(yù)變性95℃3min變性95℃15sec退火56-72℃15sec25-35延長72℃30-60sec/kb徹底延長72℃5min四、瓊脂糖凝膠電泳檢測試驗(yàn)原理自然瓊脂〔Agar〕〔Agarose80%〕及瓊脂膠〔Agaropectin〕組成。由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分別效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)展平板電泳。瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分別作用主要是依據(jù)它們的相對分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時(shí)與凝膠的濃度也有親熱關(guān)系。1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系DNA分子的大小在凝膠中，DNA片段遷移距離〔遷移率〕與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過DNA分子大小超過20kb時(shí)，一般瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時(shí)電泳的遷移率不再依靠于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分別DNA時(shí)，分子大小不宜超過此值。瓊脂脂糖的濃度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)展電泳分別。瓊脂糖濃度/%0.30.60.70.91.21.52.0線裝DNA大小/kb5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-32、核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分別的關(guān)系不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗﹥r(jià)閉環(huán)DNA〔covalentlyclosedcircular，cccDNA〕>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNDN〔一般為球形而同等大小的直線雙鏈DN〔剛性棒狀〕則可以長軸方向前進(jìn)Rm>，由此可見，這三種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時(shí)，也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。3、凝膠類型用于分別核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型〔平板型。水平型電泳時(shí)，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm于制作，又可以依據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而較受歡送。4、緩沖液系統(tǒng)DNA會(huì)造成膠熔化和DNAEDT〔pH8.和TrisTETris〔TB〕或Tris-磷酸〔TPE〕等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時(shí)稀釋到所需倍數(shù)。試驗(yàn)方法凝膠的制備3min，依據(jù)‰1參加核酸染料，倒入制膠板中，插入樣品孔梳，自然冷卻20min以上。拔梳子將凝膠放入電泳槽中，樣品孔靠近負(fù)極樣品配制與加樣DNA樣品和適量上樣緩沖液混合均勻，留神參加樣品孔中，蓋上電泳槽蓋子，100V25min。凝膠成像將凝膠放入凝膠成像儀中，觀看結(jié)果，照相分析五、PCR產(chǎn)物回收試驗(yàn)原理利用異硫氰酸胍法溶膠，利用硅膠膜離心柱特異地吸附DNATAE或TBE瓊脂糖凝膠中回DNA片段。試驗(yàn)材料手術(shù)刀、1.5ml離心管、膠回收試劑盒、離心機(jī)試驗(yàn)步驟當(dāng)DNA片段分別后，把凝膠放置于紫外燈下，快速切下含目的DNA片段的凝膠，并盡量去除多余的凝膠。稱取凝膠塊的重量，并轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。按100mg100μl體積計(jì)算，參加等倍體積BufferGDP。50~55oC水浴7~10分鐘，讓凝膠塊完全溶解。水浴期間，顛倒混勻2次加速溶膠。假設(shè)凝200mg200μlBufferGDP。(BufferGDP參加1~3倍體積都不影響DNA回收率。)假設(shè)回收小于或等于100bpDNA片段時(shí)，參加3倍體積BufferGDP，水浴溶膠后，再參加1倍體積(凝膠體積)異丙醇混勻后再按第三步進(jìn)展操作。短暫離心收集管壁上的液滴。將HiPureDNAColumn2ml收集管中。把≤700μl溶膠液轉(zhuǎn)移至柱子中。12,000g30~60秒。(可選:溶膠液超過700μl)12023×g30~60秒倒棄濾液，把柱子套回收集管中。參加300μlBufferGDP1分鐘。12,000×g離心30~60秒。倒棄濾液，把柱子套回收集管中。參加600μlBufferDW2〔已用無水乙醇稀釋〕12,000×g30~60秒。(可選)倒棄濾液，把柱子套回收集管中。參加600μlBufferDW2〔已用無水乙醇稀釋〕至柱子中。12,000g離心30~60秒。倒棄濾液，把柱子套回收集管中。12,000xg離心2分鐘。對某些敏感應(yīng)用(需將大局部洗脫液參加連接反響液時(shí))10~15分鐘以徹底去除乙醇。把柱子套在1.5ml7~30μlElutionBuffer2分鐘。12,000×g離心1DNA保存于-209步進(jìn)展其次步洗脫。3KB以上的片段時(shí)，最好把ElutionBuffer55oC。六、克隆載體連接與轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶可以在短時(shí)間將DNA和載體連接構(gòu)成一個(gè)完整的克隆載體?？寺≥d體上有復(fù)制子原件，可以使得載體在大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)展大量擴(kuò)增；克隆載體上有選擇標(biāo)記〔氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性等，使得成功轉(zhuǎn)化載體的大腸桿菌可以在具有抗生素的LB平板上生長。細(xì)胞能夠從四周環(huán)境中攝取DNA生理狀態(tài)稱感受態(tài)competenc。自然環(huán)境中細(xì)菌可以吸取外源遺傳物質(zhì)以增加自身對環(huán)境的適應(yīng)性。人工感受態(tài)的形成，需要低溫順鈣處理，這樣可能破壞了細(xì)胞膜上的脂質(zhì)陣列，Ca2+與膜上的多聚羥基丁酸化合物、多聚無機(jī)磷酸形成復(fù)合物利于外源DNA的滲入，外部理化因素促進(jìn)了感受態(tài)的形成。試驗(yàn)材料克隆載體連接試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、LB液體培育基〔每升：胰蛋白胨10g、酵母提取物5、NaCl10、LB平板培育基LB+2瓊脂、冰、水浴鍋試驗(yàn)步驟組分DNA組分DNApTOPO-BluntSimpleVector10XEnhancer體積40.50.5反響程序5min3.轉(zhuǎn)化①50μl感受態(tài)細(xì)胞，置于室溫解凍，完全解凍后輕撣幾次將細(xì)胞均勻懸浮。5μl5分鐘③42℃452700μl不含抗生LB，37℃，200rpm1037℃培育箱過夜培育。PCR驗(yàn)證試驗(yàn)原理菌落PCR〔ColonyPCR〕DNADNA為模板進(jìn)展PCR擴(kuò)增，省時(shí)少力。建議使用載體上的通用引物和目的基因特異性引物組成的穿插引