用離子交換層技術(shù)純化目的蛋白

試驗(yàn)六用離子交換層技術(shù)純化目的蛋白【試驗(yàn)?zāi)康摹俊驹囼?yàn)原理】PHPI時(shí)，被分別物質(zhì)帶負(fù)電荷，可被統(tǒng)的離子強(qiáng)度和PH值以及承受梯度洗脫方法可以使離子交換層析的區(qū)分力更高。的種類、交聯(lián)度、蛋白質(zhì)溶液和離子交換層析柱平衡液的pH值及離子強(qiáng)度等。通而，此種環(huán)境條件對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說是不易找到的。通常遇到的狀況是，在特的。性〔陽〕離子交換劑對H+Na+的?。粡?qiáng)堿性〔陰〕離子交換劑對反離子進(jìn)展電荷平衡是打算吸附容量的重要因素。pH〔PI〕時(shí)，pH環(huán)境中，PI>pH，其值相差愈遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)的堿性愈強(qiáng)帶正電荷愈多，愈易被陽離子交換劑吸附。蛋白質(zhì)是大分子物質(zhì)，其溶液呈膠體狀，因此用離子交換層析技術(shù)提純蛋白孔隙大，以利于蛋白質(zhì)分之滲透入交換劑的網(wǎng)孔中進(jìn)展離子交換吸附。蛋白質(zhì)在離子交換劑上的吸附和解吸附〔洗脫〕受環(huán)境中的pH值和離子強(qiáng)擇另外一種環(huán)境條件〔pH或轉(zhuǎn)變離子強(qiáng)度，使蛋白質(zhì)從離子交換劑上質(zhì)的離子交換層析條件〔包括吸附和洗脫兩種過程。因此，每一種蛋白質(zhì)的離進(jìn)展的而不是承受小型層析柱。通過轉(zhuǎn)變離子濃度和pH值篩選最正確吸附和洗脫條件。依據(jù)離子交換介質(zhì)所帶的反離子完全離子化的pH值范圍，將其分類為強(qiáng)陽強(qiáng)反離子的結(jié)合強(qiáng)度無關(guān)。PI來打算。由于在爭論工作開頭時(shí)，人們尚不知道目的蛋白質(zhì)的PI，所以一般先在生理pH值下對陰、陽兩種離子交換劑都做小樣試驗(yàn)。由于弱酸、弱堿性離子交換劑在生理pH值下的交換容量也作。PharmaciaSPQ型離子交換介質(zhì)的pHDEAECMpH范圍更寬，更易保持高交換樣品性質(zhì)和純化目標(biāo)來選擇適宜的離子交換介質(zhì)。如下表所示：產(chǎn)品純化 樣品性質(zhì)產(chǎn)品純化 樣品性質(zhì)/純化目標(biāo) 應(yīng)選擇的離子交換階段 及工作原則 介質(zhì)〔推舉〕捕獲及產(chǎn)品粗去除細(xì)胞碎片快速濃縮處理量越大越好，Sepharose大顆〔200μM〕分別 最短時(shí)間內(nèi)捕獲產(chǎn)品避開產(chǎn)品被降解減交換劑可在短時(shí)間里處理UV檢測的影大量樣品，陽離子交換劑響。介質(zhì)須耐受高粘度、流速快，對區(qū)分率和親和介質(zhì)可在捕獲產(chǎn)品的要求不高 的同時(shí)，去除核酸。中度純化中度純化以高選擇性離子交換介質(zhì)去除主要雜蛋白，SepharoseFF〔90μM〕適宜須留意介質(zhì)載量和區(qū)分率之間的平衡介質(zhì)用于早期純化，流速不是重要的選擇指標(biāo) SephanroseHP〔34μM〕可供給更高的區(qū)分率精細(xì)純化重要SourcetmSephacry介質(zhì)30,15SephadexR凝膠過濾通過小樣試驗(yàn)確定了最適離子交換劑以及吸附/等。劑的交換量留有充分的余地。因此層析柱的實(shí)際交換量只能是理論交換量的25-50%。在要分別的蛋白質(zhì)溶液的成分簡單，目的蛋白質(zhì)與雜質(zhì)蛋白質(zhì)性質(zhì)相用下式來計(jì)算：AW= B×C×M式中：W—離子交換劑的裝柱量，mlA—目的蛋白質(zhì)的含量mgM—目的蛋白質(zhì)的分子量Dal

〔1〕B—單位重量的離子交換劑的理論交換當(dāng)量毫克當(dāng)量/mlC—系數(shù) 一般取5%—50%H=3 400Wπ離子交換層析柱的高徑比多為10H=3 400Wπ式中：H—層析柱離子交換劑的裝填高度cm—所需交換劑的裝柱量〔由式〔1〕求得，π—3.14161則，柱的直徑D= H10的體積和待分別蛋白質(zhì)打算的。流速大小可以用體積流速〔m·c-2h1〕或線所以常用線性流速表示，兩種流速的換算關(guān)系如下：體積流速〔ml·cm-2·h-1〕線性流速〔cm·h-1〕=層析柱橫斷面面積〔cm2〕流速過大會(huì)降低層析柱的區(qū)分力。其最正確值，需試驗(yàn)確定。一般承受 10c·h1?！驹囼?yàn)器材】離心管φ10×151ml、5支、吸頭、紫外分光光度計(jì)、SDS-裝置、φ25×300玻璃層析柱、鐵架臺(tái)、木工水平尺、螺動(dòng)泵、核酸蛋白質(zhì)檢測儀、局部收集器【試驗(yàn)試劑】1．蛋白質(zhì)溶液為試驗(yàn)六得到的脫區(qū)硫酸銨的目的蛋白質(zhì)溶液；2．20mM磷酸緩沖液pH7.5NaCl的濃度為2M離子交換樹脂：弱酸性CMSephadexC弱酸性DEAESephadexA5050ml95%乙醇?！驹囼?yàn)方法】層析條件的優(yōu)化5mlCM-SephadexC-50DEAE-SephadexA-50〔本試驗(yàn)選用后者〕置于一帶有螺旋蓋的φ10×15試管中添加5ml20mM磷酸緩沖酸pH7.，顛倒試管數(shù)次后，將試管直立地放置在試管架上，讓凝膠自然沉淀，5ml吸管移去凝膠上部的緩沖液；重復(fù)上述洗滌操作10次；離心管中，分別編號(hào)為12、3、4、5；500μl脫鹽的目的蛋白溶液；400μl200mM磷酸緩沖2MNaClNaCl50mM100mM200mM300mM400mM5—1015min50μl上清，制SDS-樣〔一脫鹽后的目的蛋白作比照〕清中雜蛋白多，目的蛋白少的一管的鹽濃度作為上柱時(shí)的洗柱緩沖液。B．洗脫條件確實(shí)定將“A”DEAE-SephadexA50Eppendorf200μl；500μl400μlNaClA”NaClA〔6〕操作后，離心除去上清；〔3〕1、2、3、45pH5.8、6.4、6.8、7.58.0的含有于吸附時(shí)一樣濃度NaCl的磷酸緩沖液1ml，重復(fù)A〔6〕~〔8〕操作，觀看目的蛋白洗脫狀況?！?〕選擇目的蛋白質(zhì)洗脫量最高的緩沖液作洗脫用緩沖液；裝制離子交換層析柱依據(jù)測定的目的蛋白質(zhì)在試驗(yàn)六得到的脫鹽蛋白質(zhì)溶液中的含量和本試驗(yàn)“1”選頂?shù)碾x子交換劑的吸水量技術(shù)出所需層析柱的尺寸；外表的上清以除去微小的顆粒。假設(shè)選用的離子交換劑是弱酸性的，則向用水浸泡過的交換劑中假設(shè)20.5mol/L30交換劑，直至漂洗水呈中性后，假設(shè)0.5mol/LNaOH30NaOH處理，HCl處理。起目的是使弱酸性交換劑帶的反離子是Na+，而弱酸性交換劑以Cl-作為反離子，以增加交換劑的交換量。1/2存在，可承受開啟出液閥排解。將處理好的交換劑灌注如層析柱中，待交換劑下2-340ml/h隨時(shí)將剩余的交換劑懸浮液添加到層析柱中，使交換劑裝填均勻、無氣泡。輸液量以調(diào)整至40ml/h的蠕動(dòng)泵向聯(lián)，翻開柱底出液閥開動(dòng)蠕動(dòng)泵，使二倍柱床體積的蒸餾水通過層析柱；關(guān)閉蠕動(dòng)泵，并取下柱頂塞，讓柱頂上的蒸餾水的彎月面降至與主廠頂〔1”確定〕留神沖洗柱壁，使粘在柱壁上的樣品完全進(jìn)入柱床；關(guān)閉柱底出液閥后，留神講洗柱液灌注如柱床頂部空間后塞上柱頂塞，并將其與上述蠕動(dòng)泵相聯(lián)。翻開柱底出液閥，開動(dòng)蠕動(dòng)泵，將2倍柱床體積的洗柱液送入層析柱，洗去未被吸附的雜蛋白；將柱底出液毛細(xì)管通過核酸蛋白質(zhì)檢察儀同分部體積已調(diào)至1.5ml的部分收集器相聯(lián)后，將蠕動(dòng)泵吸液管插入到洗脫液瓶中〔1”確定2洗脫柱床中吸附的目的蛋白質(zhì)；核算蛋白質(zhì)檢察儀連接的記錄器畫出的層析