核酸分子雜交與應(yīng)用描述

核酸分子雜交技術(shù)與應(yīng)用2/24/20231核酸分子雜交：來(lái)源相同或不同的DNA甚至DNA與RNA分子變性后，在合適的條件下通過(guò)堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交體的過(guò)程稱(chēng)核酸分子雜交(molecularhybridization)。核酸分子雜交技術(shù)是目前生物化學(xué)和分子生物學(xué)探討中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，也是臨床分子檢驗(yàn)的重要技術(shù)。2/24/202322/24/20233核酸分子雜交的基本原理與分類(lèi)核酸分子雜交的基本原理：DNA分子由兩條互補(bǔ)的單鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的力有三：1、兩條鏈間互補(bǔ)堿基的氫鍵；2、堿基間的積累力(范德華力)；3、中和鏈內(nèi)的負(fù)電荷。變性：在理化因素作用下，雙螺旋結(jié)構(gòu)間的氫鍵斷裂，兩條鏈解開(kāi)形成單鏈的過(guò)程。2/24/202342/24/20235變性溫度(Tm)：核酸分子熱變性時(shí)，從起先變性到變性結(jié)束，是在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的，當(dāng)變性進(jìn)行到核酸分子解鏈一半時(shí)的溫度，稱(chēng)變性溫度，也稱(chēng)融解溫度。2/24/202362/24/20237影響變性的因素：1、堿基組成DNA分子中G＋C含量越高Tm越高。在1×SSC溶液中，兩者之間的關(guān)系可以用閱歷公式表示：Tm＝(G+C)%×0.41+69.3其中，69.3為無(wú)G＋C存在時(shí)的Tm值。(G+C)%每增加1％，Tm約上升0.41oC。2/24/20238影響變性的因素：2、溶液的離子強(qiáng)度DNA鏈骨架上的磷酸基團(tuán)帶有較多的負(fù)電荷，它們之間的靜電相斥作用是其雙鏈的不穩(wěn)定因素之一。在無(wú)鹽的水中，DNA在室溫下就會(huì)變性，加入鹽后，正離子可以封閉磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，使DNA穩(wěn)定性增加，Tm值上升。2/24/20239影響變性的因素：3、pH值pH值在5～9范圍內(nèi)，Tm值變更不明顯。在高pH值下，可使堿基失去形成氫鍵的實(shí)力。當(dāng)pH大于11.3時(shí)全部氫鍵均被破壞，DNA完全變性。4、變性劑可以干擾堿基積累力和氫鍵的形成，因此可以降低Tm值。常用的變性劑是甲酰胺和脲，通常用50％的甲酰胺以使Tm值降低30oC。2/24/202310復(fù)性：變性核酸分子在合適的條件下重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱(chēng)復(fù)性。熱變性的DNA溶液在低于Tm值25oC的溫度下維持相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間，則可使之復(fù)原到自然的雙鏈結(jié)構(gòu)狀態(tài)。復(fù)性的速度受以下因素影響：1、DNA濃度DNA濃度越大復(fù)性速度越快；2、DNA的分子質(zhì)量大分子質(zhì)量的DNA擴(kuò)散速度慢，復(fù)性速度慢；2/24/2023113、溫度溫度過(guò)高，有利于DNA變性而不利于復(fù)性；4、離子強(qiáng)度5、DNA分子的困難性DNA總量確定時(shí)，基因組越困難，其中特定依次的拷貝數(shù)越少，互補(bǔ)依次的濃度越低，復(fù)性反應(yīng)速度越慢。2/24/202312分子雜交技術(shù)就是利用了核酸分子的變性與復(fù)性原理，使變性的核酸分子與檢測(cè)核酸分子在堿基互補(bǔ)的條件下形成雜交雙螺旋的過(guò)程。探針(probe)：在核酸變性試驗(yàn)中，為使雜交體與單鏈核酸分子區(qū)分開(kāi)來(lái)所運(yùn)用的帶有標(biāo)記的單鏈核酸分子。2/24/202313核酸分子雜交分類(lèi)：以雜交分子分類(lèi)：DNA與DNA雜交；DNA與RNA雜交；RNA與RNA雜交。以探針標(biāo)記分類(lèi)：以雜交介質(zhì)分類(lèi)：液相雜交與固相雜交。液相雜交：菌落雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、原位雜交及基因芯片等技術(shù)。2/24/202314液相雜交(solutionhybridization)：是一種比較原始的分子雜交技術(shù)。待測(cè)分子與探針在雜交液中完成反應(yīng)，利用層析方法將雜交分子與末雜交分子分開(kāi)后用液閃儀進(jìn)行計(jì)數(shù)或利用紫外吸取特性變更分析雜交結(jié)果的分子雜交類(lèi)型。液相雜交又分為：RNA酶疼惜分析法、核酸酶S1疼惜分析法。2/24/202315RNA酶疼惜分析法(RPA)：利用RNaseA和RNaseT1能專(zhuān)一性降解單鏈RNA而雙鏈RNA受到疼惜的特點(diǎn)，用體外轉(zhuǎn)錄合成的放射性標(biāo)記的RNA探針與待檢mRNA進(jìn)行液相雜交，使互補(bǔ)序列RNA探針和待測(cè)RNA形成雜交體，用RNase降解非雜交部分RNA后分析雜交結(jié)果。2/24/202316RNA酶疼惜分析法的應(yīng)用：mRNA定量mRNA未端定位內(nèi)含子在相應(yīng)基因中的位置2/24/202317RNA酶疼惜分析法的主要步驟：1、制備待測(cè)RNA從細(xì)胞或組織中提取總RNA或mRNA；2、RNA探針標(biāo)記接受體外轉(zhuǎn)錄的方法制備和標(biāo)記探針；3、分子雜交：將待測(cè)樣品RNA和RNA探針在液相中雜交，雜交前將樣品和探針變性，破壞二級(jí)結(jié)構(gòu)；4、RNA酶消化單鏈RNA；5、電泳分析雜交分子。2/24/202318核酸酶S1疼惜分析法(nucleaseS1protectionassay)：原理與RNA酶疼惜分析法的原理類(lèi)似，核酸酶S1能專(zhuān)一性地降解單鏈DNA和RNA，而不能降解DNA/RNA雜交雙鏈。接受M13體系克隆和擴(kuò)增特定基因的單鏈DNA片段，在合成過(guò)程中加入核素標(biāo)記物，即可合成出高放射性的單鏈DNA探針。將探針與待測(cè)RNA樣品在液相中進(jìn)行雜交，形成DNA/RNA雜交雙鏈。酶解后進(jìn)行分析。2/24/202319核酸酶S1疼惜分析法可用于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分析及內(nèi)含子剪切位點(diǎn)分析。液相雜交的優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)潔、操作便利。液相雜交的缺點(diǎn)：過(guò)量未雜交探針難以除去，產(chǎn)生高背景；同源與異源核酸均可形成雙螺旋結(jié)構(gòu)使得雜交結(jié)果難以分析。2/24/202320固相雜交：將欲分析的樣品先結(jié)合在固相支持物上，再與探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交結(jié)果可用儀器或放射自顯影技術(shù)分析雜交結(jié)果。固相支持物的選擇：可用于固相支持物的種類(lèi)很多。一種良好的固相支持物應(yīng)具備以下幾個(gè)特性：1、具有較強(qiáng)的結(jié)合核酸分子的實(shí)力；2、與核酸分子結(jié)合后不影響與探針的結(jié)合；3、與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定堅(jiān)實(shí)；4、非特異性吸附少；5、具有良好的機(jī)械性能便于操作。2/24/202321硝酸纖維素濾膜優(yōu)點(diǎn)：具有較強(qiáng)的吸附單鏈DNA或RNA的實(shí)力，特殊是在高鹽濃度下，其結(jié)合實(shí)力可達(dá)80～100μg/cm2。吸附的單鏈核經(jīng)真空烘烤后，依靠疏水性相互作用而結(jié)合在硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜具有雜交信號(hào)本底低的特點(diǎn)廣泛用于各種雜交試驗(yàn)。缺點(diǎn)：與單鏈核酸的結(jié)合實(shí)力不特殊堅(jiān)實(shí)，尤其是小于200bp的DNA片段，洗膜時(shí)(特殊是在高溫下)DNA會(huì)出現(xiàn)脫膜現(xiàn)象，硝酸纖維素膜質(zhì)地較脆使操作不便。2/24/202322尼龍膜：是目前較志向的一種核酸固相支持物，它有多種類(lèi)型，不同類(lèi)型的膜上網(wǎng)孔大小不同。經(jīng)正電荷基團(tuán)修飾后與核酸的結(jié)合力更強(qiáng)。尼龍膜與核酸的結(jié)合實(shí)力為350～500μg/cm2。經(jīng)烘烤或紫外線照射后，特殊是紫外線照射，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上帶正電荷的基團(tuán)相互交聯(lián)，使結(jié)合更加堅(jiān)實(shí)。2/24/202323菌落雜交：主要用于克隆篩選的固相雜交。2/24/202324Southern印跡雜交：Northern印跡雜交：基本原理與Southern相同，但目的被分析樣品為RNA。選擇的變性劑為甲醛。斑點(diǎn)雜交及狹縫雜交：原位雜交(insituhybridization)：基因芯片技術(shù)：2/24/202325雜交過(guò)程預(yù)雜交：為了削減非特異性雜交反應(yīng)，在雜交前應(yīng)進(jìn)行預(yù)雜交，將非特異性DNA位點(diǎn)封閉。常用的封閉物有兩類(lèi)：其一是變性的非特異性DNA，大多接受鮭魚(yú)精子DNA或小牛胸腺DNA；其二是一些高分子化合物，其作用有二：封閉DNA上的非特異位點(diǎn)；封閉膜上與非特異性DNA結(jié)合位點(diǎn)。2/24/202326預(yù)雜交液的配制6×SSC（1×SSC為0.15mol/LNaCl和o.o15mol/L檸檬酸）5×Denhardt’s溶液0.5％SDS100μg/ml變性的鮭魚(yú)精子DNA50％甲酰胺(可不用)50×Denhardt：聚蔗糖(Ficoll400)5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血清白蛋白(組分V)5g加水至500ml，分裝后保存于－20oC2/24/20232710mg/ml鮭魚(yú)精DNA：超聲法或用注射器通過(guò)6號(hào)針頭反復(fù)抽打?qū)NA打斷。煮沸后置－20oC保存，運(yùn)用前置沸水浴中煮沸5分鐘后速置冰浴中。甲酰胺：運(yùn)用前用DowexXG8混合床陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理1小時(shí)，小量分裝后置－70oC保存。2/24/202328膜的處理：將結(jié)合了DNA(或RNA)的硝酸纖維素膜或尼龍膜浸泡于6×SSC溶液中2分鐘，使其充分潮濕。預(yù)雜交：將潮濕的濾膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜0.2ml量加入預(yù)雜交液，盡量解除其中的氣泡后用封口機(jī)封口。2/24/202329溫育：將雜交袋浸入適當(dāng)溫度的恒溫水浴中(不加甲酰胺時(shí)用68oC；加入50％甲酰胺時(shí)，恒溫42oC)，溫育1～2小時(shí)，也可延長(zhǎng)至12～16小時(shí)。保溫過(guò)程中應(yīng)不斷搖動(dòng)塑料袋，以趕走蓋在濾膜表面的氣泡，否則這些氣泡將阻礙雜交液與濾膜的接觸。(假如將預(yù)雜交液加熱到適當(dāng)溫度后再加入塑料袋內(nèi)，可以削減氣泡產(chǎn)生)。2/24/202330雜交：雜交反應(yīng)是單鏈核酸探針與待測(cè)核酸分子中的特異基因序列在確定的溫度下雜交復(fù)性的過(guò)程。雜交包括以下過(guò)程：1、雜交液配制：同預(yù)雜交液2、探針變性：放射性標(biāo)記的探針為雙鏈時(shí)，于100oC加熱5分鐘變性并快速在冰水浴中將探針驟冷。單鏈探針無(wú)須變性2/24/2023313、打開(kāi)預(yù)雜交袋棄去預(yù)雜交液，加入雜交液及變性的探針。解除氣泡后重新封好口4、在與預(yù)雜交相同溫度下，保溫8～16小時(shí)2/24/202332洗膜：是將濾膜上未與DNA雜交的及非特異性雜交的探針?lè)肿訌臑V膜上洗去的過(guò)程，非特異性雜交體穩(wěn)定性較低，解鏈溫度較低，在確定溫度下，非特異性雜交體解鏈而被洗掉，而特異性雜交體則保留在濾膜上。雜交體的解鏈溫度主要取決于雜交體的同源性和溶液的離子強(qiáng)度兩個(gè)要素，同源性越高離子強(qiáng)度越高，雜交體的穩(wěn)定性越高。2/24/202333洗膜的操作如下：1、雜交完畢，取出雜交袋，剪去一角，棄去全部的雜交液，取出膜并快速浸泡于大量2×SSC和0.5%SDS溶液中，室溫下不斷振蕩。留意不要使濾膜干燥。2、5分鐘后，將濾膜轉(zhuǎn)移至一盛有大量2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，室溫振蕩15分鐘。2/24/2023343、將濾膜轉(zhuǎn)移至一盛有大量0.1×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，37oC振蕩漂洗30分鐘至1小時(shí)。4、將濾膜轉(zhuǎn)移至一盛有大量0.1×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，65oC振蕩漂洗30分鐘至1小時(shí)。直到用蓋革計(jì)數(shù)器在無(wú)DNA區(qū)域檢測(cè)不出放射信號(hào)為止。5、室溫下，濾膜用0.1×SSC稍稍漂洗。然后置濾紙上吸去溶液，置－70oC放射自顯影。2/24/202335非放射性標(biāo)記探針雜交非放射性標(biāo)記探針的缺點(diǎn)是雜交后本底信號(hào)較強(qiáng)，因此雜交條件與放射性標(biāo)記探針稍有差別以削減本底。主要變更為用甘氨酸代替雜交液中的牛血清白蛋白，并削減硫酸葡聚糖用量，此法也適用于放射性探針雜交。2/24/202336雜交液組成：50％甲酰胺5xSSC1xFPG25mmol/L磷酸緩沖液25μg/ml變性鮭魚(yú)精DNA5％硫酸葡聚糖0.2％SDS50xFPG1％聚蔗糖4001％聚乙烯吡咯烷酮1％甘氨酸過(guò)濾后分裝，于－20oC存放。2/24/202337雜交反應(yīng)的影響因素長(zhǎng)探針雜交影響雜交速率和雜化分子穩(wěn)定性的因素1、核酸分子濃度與雜交速率：在探針和固定的核酸濃度都很低的狀況下，雜交初始速度由探針和核酸濃度確定。當(dāng)探針是單鏈而不存在自身互補(bǔ)的區(qū)域，雜交的速率隨探針濃度的上升而上升。在雜交中可通過(guò)提高探針的擴(kuò)散速率而提高雜交速率，如使小片段探針、減小反應(yīng)體積提高反應(yīng)溫度和不斷振搖等措施。2/24/2023382、高濃度雙鏈探針的雜交：限制性?xún)?nèi)切酶標(biāo)記的探針，在雜交過(guò)程中可能發(fā)生兩種反應(yīng)：1、與固定在膜上的靶序列雜交；2、雙鏈探針的自身退火。雙鏈探針的自身退火可使探針有20％～30％探針不能與靶序列發(fā)生雜交，因此盡量運(yùn)用單鏈探針。3、堿基組成：G＋C的含量越高，雜交的速率越高，但對(duì)速率的影響不明顯，可忽視不計(jì)。但G＋C含量越高雜交核酸的穩(wěn)定性越高。2/24/2023394、鹽溶液的濃度：對(duì)雜交速率的影響：對(duì)雜交穩(wěn)定性的影響：5、溫度6、甲醛7、錯(cuò)配的核酸序列：2/24/202340酶聯(lián)探針屬于非放射性探針，探針與生物素或地高辛結(jié)合后與氫過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶連接。雜交反應(yīng)體積雜交時(shí)間2/24/202341探針的種類(lèi)DNA探針：雙鏈或單鏈DNA探針是最常用的核酸探針。長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上。DNA探針又分為：基因組DNA探針：有細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)、真菌、動(dòng)物和人類(lèi)細(xì)胞DNA探針，多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。cDNA探針：以mRNA為模板經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生的互補(bǔ)于mRNA的DNA鏈。2/24/202342探針的種類(lèi)DNA探針優(yōu)點(diǎn)：1、多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖；2、DNA探針不易降解3、DNA的標(biāo)記方法比較成熟。2/24/202343探針的種類(lèi)RNA探針：可以是標(biāo)記分別的RNA，也可以是重組質(zhì)粒在RNA聚合酶作用下的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。其優(yōu)點(diǎn)是：RNA探針為單鏈，困難性低，與靶序列雜交反應(yīng)效率極高因不存在重復(fù)序列，因此特異性高本底低缺點(diǎn)：2/24/202344探針的種類(lèi)寡核苷酸(oligo)探針：由17～50mer組成的短探針。優(yōu)點(diǎn)：可依據(jù)須要人工合成相應(yīng)的序列；因片段短，只有一個(gè)核苷酸突變，其Tm值也有明顯變更，特殊適用于點(diǎn)突變的檢測(cè)雜交速度快特異性強(qiáng)缺點(diǎn)：所帶標(biāo)記物少靈敏度低；片段短雜交體不穩(wěn)定2/24/202345探針的標(biāo)記標(biāo)記物：標(biāo)記探針的標(biāo)記物有兩大類(lèi)1、放射性標(biāo)記2、非放射性標(biāo)記非放射性標(biāo)記又分為：(1)半抗原：如生物素和地高辛，可以利用這些半抗原的抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)(2)配體：如生物素還是一種抗生物素蛋白和鏈霉素類(lèi)抗生物素蛋白配體，可以利用親和法進(jìn)行檢測(cè)(3)熒光素：可以被紫外線激發(fā)出熒光進(jìn)行視察，主要用于原位雜交。2/24/202346探針的標(biāo)記切口平移法標(biāo)記原理：是目前試驗(yàn)室是最常用的一種脫氧核糖核酸探針標(biāo)記法。利用大腸桿菌DNA聚合酶1的多種酶促活性將標(biāo)記的dNTP摻入新合成DNA鏈中使探針被標(biāo)記。帶缺口(nick)的線狀、超螺旋及環(huán)狀雙鏈DNA均可作為切口平移法的模板。2/24/202347DNaseIDNAPolI,α-32P-dNTP2/24/2023482/24/2023492/24/202350標(biāo)記步驟1、取1μgDNA溶于少量無(wú)菌蒸餾水中2、加入μl10x切口平移緩沖液，混勻10x切口平移緩沖液0.5mol/LTris.Cl(pH7.2)0.1mol/LMgSO41mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)500μg/ml牛血清白蛋白2/24/202351標(biāo)記步驟3、加入除標(biāo)記核苷酸外的其他三種脫氧核糖核苷酸溶液(也可以是多種標(biāo)記核苷酸)，20mmol/L溶液各1μl。以下操作要在同位素工作室中有防護(hù)措施的狀況下進(jìn)行操作4、加入100μCi(10μl)標(biāo)記的核苷酸溶液。注：應(yīng)貯存在－20oC冰箱中，運(yùn)用前在室溫下放置15～30分鐘溶化。要盡量削減凍融次數(shù)。2/24/202352標(biāo)記步驟5、加入無(wú)菌蒸餾水，至終體積為46.5μl，混勻6、加入0.5μl稀釋的DNaseI溶液，混勻7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混勻注：以上操作均在冰浴中進(jìn)行8、置14～16oC水浴中保溫1～2小時(shí)9、加入2μl0.5mol/LEDTA終止反應(yīng)10、純化標(biāo)記的DNA探針2/24/202353探針的標(biāo)記隨機(jī)引物法標(biāo)記原理：隨機(jī)引物是含有各種可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以與任何核酸序列雜交，起到聚合酶促反應(yīng)的引物作用。將待標(biāo)記的探針模板與隨機(jī)引物一起退火，合成標(biāo)記探針。2/24/2023542/24/2023552/24/202356標(biāo)記步驟1、冰浴中，在一微量離心管內(nèi)依次加入下列溶液，并混勻20mmol/LDTT1μl5mmol/LdATP、dGTP、dTTP1μl10x隨機(jī)引物緩沖液1μl標(biāo)記dCTP3μl水1μl2/24/202357標(biāo)記步驟2、取200ng雙鏈DNA溶于1μl蒸餾水中，在蠟?zāi)ど吓c1μl隨機(jī)引物充分混勻，吸入一毛細(xì)玻璃管中，用火封嚴(yán)兩端。置沸水浴中30分鐘并快速置冰水浴中1分鐘。將DNA轉(zhuǎn)入上述離心管中3、加入1μl(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混勻并離心，室溫反應(yīng)3小時(shí)以上2/24/202358標(biāo)記步驟4、取10μl終止緩沖液，置－20oC保存?zhèn)溆媒K止緩沖液50mmol/LTris.Cl(pH7.5)50mmol/LNaCl5mmol/LEDTA0.5%SDS2/24/2023592/24/202360隨機(jī)引物標(biāo)記法特點(diǎn)1、除能進(jìn)行雙鏈DNA標(biāo)記外，也可用于單鏈DNA或RNA探針的標(biāo)記。當(dāng)用RNA為模板是，操作方法同上，但必需接受反轉(zhuǎn)錄酶。2、標(biāo)記活性高，只需25ng樣品DNA，可在3小時(shí)內(nèi)使40％～60％以上甚至90％的標(biāo)記dNTP摻入到探針DNA鏈上3、操作便利2/24/2023613’末端標(biāo)記末端標(biāo)記屬于部分標(biāo)記。特點(diǎn)是可得到全長(zhǎng)DNA片段，但標(biāo)記活性不高。3’末端標(biāo)記法包括限制酶切和聚合酶合成兩個(gè)過(guò)程，3’標(biāo)記有兩種方式：大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段末端標(biāo)記法T4DNA聚合酶標(biāo)記法2/24/202362大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段末端標(biāo)記法：標(biāo)記反應(yīng)步驟：(1)在反應(yīng)管中依次加入下列試劑并混勻DNA1μg10xKlenow片段緩沖液2μl2mmol/L3種dNTP(無(wú)dATP)1μl[α-32P]dATP30μCi加水至25μl10xKlenow片段緩沖液2μl0.5mol/LTris.Cl(pH7.2)0.1mmol/LMgSO4

1mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)500μg牛血清白蛋白2/24/202363(2)加入1單位Klenow聚合酶片段，室溫反應(yīng)30min。(3)加入12μl0.5mol/LEDTA以終止反應(yīng)。酚/氯仿抽提1次。(4)SephadexG－50柱層析或乙醇沉淀法分別標(biāo)記的DNA片段。大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段末端標(biāo)記法：2/24/202364留意事項(xiàng)：(1)要依據(jù)不同限制酶產(chǎn)生的不同粘性末端選擇不同的標(biāo)記核苷酸。(2)選擇適當(dāng)?shù)南拗泼讣唉?32P-dNTP,利用DNA聚合酶IKlenow片段的末端填充活性，可以選擇性地將DNA雙鏈之中一條鏈特異地標(biāo)記。(3)此方法不能干脆用于3’凸出末端DNA的標(biāo)記。2/24/202365CCTAGGAATTCAATTCCCTAGGEcoRIBamHI加入DNA聚合酶，dNTP(其中一種為標(biāo)記核苷酸)AATTCCCTAGG2/24/202366T4DNA聚合酶標(biāo)記法T4DNA聚合酶具有兩種功能，5’→3’聚合活性和3’→5’外切活性。當(dāng)反應(yīng)體系中缺乏dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶主要表現(xiàn)為外切酶活性。利用這一特性可產(chǎn)生5’凸出的DNA片段，然后加入dNTP，其中之一為標(biāo)記核苷酸，在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成出標(biāo)記探針。2/24/202367T4DNA聚合酶，無(wú)dNTP加入dNTP,其中一種為標(biāo)記核苷酸2/24/202368標(biāo)記反應(yīng)步驟：(1)在反應(yīng)管中加入下列試劑并混勻DNA0.2~0.5μg1xT4DNA聚合酶緩沖液2μl加水至20μl(2)加入所需的限制酶，并在適當(dāng)條件下溫育(3)加入適量T4DNA聚合酶。(4)當(dāng)切除了所需數(shù)量的核苷酸后，加入1μl2mmol/L四種核苷酸(其中一種為標(biāo)記核苷酸)，37oC保溫一小時(shí)。(5)SephadexG－50柱層析或乙醇沉淀法分別標(biāo)記的DNA片段。2/24/2023695’末端標(biāo)記標(biāo)記原理：在T4多核苷酸激酶的催化下，可使ATP分子上的γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA或RNA分子的5’－OH基團(tuán)上。因此接受γ-32P-ATP為底物，即可將DNA樣品5’端標(biāo)記。但核酸樣品5’端必需是去磷酸的。2/24/202370PP磷酸酶T4多核苷酸激酶ATPPP2/24/202371標(biāo)記反應(yīng)步驟：(1)堿性磷酸酶的預(yù)處理：堿性磷酸酶(CIP)硫酸銨懸液4oC下在Eppendorf離心管中離心1分鐘。棄上清，沉淀重溶于少量水中。4oC下此溶液可保存一個(gè)月以上。(2)將DNA樣品溶解于少量10mmol/Ltris.Cl(pH8.0)溶液中，然后加入：2/24/20237210xCIP緩沖液5μlCIP緩沖液適量加水至48μl置37oC30分鐘。加入其次份CIP，接著保溫30分鐘，即可脫去5’端磷酸基團(tuán)。0.01U的CIP，可脫去1pmol5’磷酸基團(tuán)(1.6μg4kb線性DNA的5’端數(shù)相當(dāng)于1pmol)。10xCIP緩沖液Tris.Cl(pH9.0)10mmol/LMgCl21mmol/L