人類精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第五版 上

圖解14中細(xì)胞評(píng)估細(xì)胞細(xì)胞類型1巨噬細(xì)胞2異常精子3分裂中的精子細(xì)胞4分裂中的精子細(xì)胞5胞質(zhì)6未分類的7退化的精子細(xì)胞8退化的精子細(xì)胞9退化的精子細(xì)胞10退化的精子細(xì)胞11巨噬細(xì)胞12退化的精子細(xì)胞13退化的精子細(xì)胞14退化的精子細(xì)胞15退化的精子細(xì)胞16巨噬細(xì)胞2.17精子形態(tài)學(xué)涂片分析2.17.1正常精子形態(tài)學(xué)分析正常精子各部分比例較容易評(píng)估，以此標(biāo)準(zhǔn)，各精子功能區(qū)比較容易評(píng)估沒(méi)有必要去區(qū)分精子頭部尺寸和外形的變異及頸部和尾部主段的缺陷。為防止觀察區(qū)視野選擇的偏頗，應(yīng)系統(tǒng)選擇涂片觀察區(qū)視野對(duì)可評(píng)估精子形態(tài)學(xué)評(píng)估。用xiooo倍油鏡觀察形態(tài)學(xué)涂片。2．依次評(píng)估視野中的所有精子。3．為達(dá)到最低的樣本誤差，應(yīng)重復(fù)觀察評(píng)估至少200個(gè)精子（見(jiàn)框2.5）。4．以實(shí)驗(yàn)室計(jì)數(shù)器分別記錄正常和異常精子數(shù)。5．最好同時(shí)做兩張涂片，于另一張涂片上重復(fù)觀察評(píng)估200個(gè)精子。6．比較兩次評(píng)估正常精子比例。7．計(jì)算兩次評(píng)估正常精子比例均值和誤差。8確定可接受的誤差，參見(jiàn)表2.1、圖A7.2、附錄7（反映兩次計(jì)數(shù)百分?jǐn)?shù)之間的最大誤差）。9．如果誤差在可接受范圍之內(nèi)，則按兩次計(jì)數(shù)的平均數(shù)；如誤差較大，則需用相同的涂片重新評(píng)估（見(jiàn)框2.6）。10．按正常形態(tài)精子平均百分?jǐn)?shù)出報(bào)告。注1：因?yàn)榫佑?jì)數(shù)時(shí)只計(jì)數(shù)無(wú)損傷的精子，而不計(jì)數(shù)其它圓細(xì)胞，所以形態(tài)學(xué)評(píng)估時(shí)需評(píng)估有完整頭尾的無(wú)損傷精子（見(jiàn)2.7.3節(jié)）。注2：不要評(píng)估重疊的和頭部位于邊緣的精子，這類精子無(wú)法充分評(píng)估。如碎片或顆粒物質(zhì)較多（如液化不良的精液，見(jiàn)節(jié)），應(yīng)重新涂片評(píng)估（見(jiàn)節(jié)）。必要時(shí)標(biāo)本要清洗處理，載玻片涂片前也要清洗（見(jiàn)節(jié)）。示例例1：計(jì)數(shù)200個(gè)精子后，正常形態(tài)精子百分比分別為18%和9%。均值為14%，差值為9%。由表2.1可見(jiàn)均值為12%，樣本誤差允許范圍為7%。本次評(píng)估樣本誤差超出7%，故需要重新評(píng)估。例2：計(jì)數(shù)200個(gè)精子后，正常形態(tài)精子百分比分別為10%和14%。均值為12%，差值為4%。由表2.1可見(jiàn)均值為12%，樣本誤差允許范圍為7%。本次評(píng)估樣本誤差低于7%，故本次評(píng)估值可信，按均值12%出報(bào)告。參考低值參考低值：正常形態(tài)精子比例為4%。注釋：每次射出精液中正常形態(tài)精子數(shù)目有重要生物學(xué)意義。為正常形態(tài)精子數(shù)除以每次射出精子總數(shù)（見(jiàn)2.8.7節(jié)）。異常形態(tài)精子形態(tài)學(xué)評(píng)估分類異常形態(tài)精子具有診斷和研究意義。如果可能，需要將缺陷類型分類，并計(jì)數(shù)各缺陷類型精子百分?jǐn)?shù)。頭、頸、尾部缺陷分表表示為％H、％M、％P,帶多余胞漿小滴的表示為％C。需要應(yīng)用多鍵計(jì)數(shù)器，其中一鍵表示正常精子，另一鍵表示缺陷精子，上述四類缺陷各占一鍵。這種計(jì)數(shù)器可保證每個(gè)精子只被計(jì)數(shù)一次，而同時(shí)每種缺陷都能被單獨(dú)計(jì)數(shù)。1．兩次計(jì)數(shù)總共評(píng)估400個(gè)精子，可以分別得到正常形態(tài)精子和缺陷精子的百分比（兩數(shù)相加為100%）。同時(shí)也可得到每種缺陷類型精子百分比（因?yàn)橛谢旌先毕荽嬖冢运姆N缺陷類型精子百分比相加不是100%）。2．缺陷精子百分比為各種類型缺陷精子數(shù)除以精子總數(shù)。各種類型缺陷精子百分比可以用來(lái)計(jì)算多重精子缺陷指數(shù)（見(jiàn)3.1節(jié)）。示例例：用6鍵計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)評(píng)估200個(gè)精子，其中42個(gè)精子被計(jì)數(shù)為正常形態(tài)精子，158個(gè)鏡子被計(jì)數(shù)為缺陷精子。缺陷精子中，140個(gè)為頭部缺陷，102個(gè)為頸部缺陷，30個(gè)為尾部缺陷，44個(gè)有多余胞漿小滴。第二次評(píng)估結(jié)果為36個(gè)精子被計(jì)數(shù)為正常形態(tài)精子，164個(gè)精子被計(jì)數(shù)為缺陷精子。缺陷精子中，122個(gè)為頭部缺陷，108個(gè)為頸部缺陷，22個(gè)為尾部缺陷，36個(gè)有多余胞漿小滴。查表可知兩次計(jì)數(shù)樣本誤差為可接受范疇。第一次評(píng)估正常形態(tài)精子比例21%，第二次評(píng)估正常形態(tài)精子比例為18%。平均值19.5%（接近正常均值20%），差值為3%。從表2.1可知正常均值為20%時(shí)，樣本誤差率不能超過(guò)8%，故本次評(píng)估值可信。結(jié)果報(bào)告為：正常形態(tài)精子比例為（42+36）/400=20%，頭部缺陷精子比例為（140+122）/400=66%，頸部缺陷精子比例為（102+108）/400=53%，尾部缺陷精子比例為（30+22）/400=13%，帶胞漿小滴精子比例為（44+36）/400=20%。注：因?yàn)橛谢旌先毕荽嬖冢运姆N缺陷類型精子百分比相加不1是00%。注釋：更多精子缺陷的細(xì)節(jié)分析和多重精子缺陷見(jiàn)3.1.1節(jié)。2.17.6特異性精子缺陷評(píng)估有時(shí)部分精子會(huì)有一些特異性結(jié)構(gòu)缺陷。比如：頂體未發(fā)育導(dǎo)致的小圓頭缺陷或環(huán)形精子缺陷。如果頂體對(duì)側(cè)精子基底發(fā)育不良，觀察時(shí)僅能看到精子的尾部（針形缺陷）。注1：針形頭精子（自由尾）不能評(píng)估為頭部缺陷，因?yàn)槲挥诨装迩安康尼樞晤^中不含染色質(zhì)，也沒(méi)有精子頭部的結(jié)構(gòu)。注2：自由尾（針形頭）和自由頭在計(jì)數(shù)時(shí)不計(jì)入（定義為一個(gè)精子頭或精子尾，見(jiàn)2.7.3節(jié)），不能認(rèn)為它們是缺陷精子。如患者的精子全部表現(xiàn)為一種缺陷，那此患者通常表現(xiàn)為不育。這種情況雖少見(jiàn)，但需要準(zhǔn)確辨別和評(píng)估、報(bào)告。報(bào)告中應(yīng)詳細(xì)描述精子缺陷的細(xì)節(jié)，如：無(wú)尾、無(wú)頭（針形頭）、無(wú)頂體等。一般患者的精子都是普遍存在多種缺陷的。N代表某一特定計(jì)數(shù)區(qū)評(píng)估400個(gè)精子后發(fā)現(xiàn)的缺陷精子數(shù)，S代表精子密度（106/ml）,缺陷精子密度表示為C（106/ml）,缺陷精子密度計(jì)算公式為C=SX（N/400）O2.18精液中白細(xì)胞的評(píng)估白細(xì)胞，主要為帶分葉核的中性粒細(xì)胞（PMN）,存在于大多數(shù)人的精液中。巴氏染色精液涂片觀察白細(xì)胞和精子細(xì)胞、精母細(xì)胞還是有顯著差異的（見(jiàn)2.14.2節(jié)）。區(qū)分主要是以上幾類細(xì)胞著色、細(xì)胞的大小和形狀存在較大差異（Johanlsson等，2000）（見(jiàn)精液涂片圖解6、10、11、12、13、14）。帶分葉核的中性粒細(xì)胞很容易和多核的精子細(xì)胞相混淆，但染色后相對(duì)較好分辨，中性粒細(xì)胞被染為藍(lán)色，而精子細(xì)胞被染為粉紅色（Johanlsson等，2000）。胞核的大小也有助于分辨：?jiǎn)渭?xì)胞核隨胞核的大小可以分辨淋巴細(xì)胞（7pm）和巨噬細(xì)胞（15pm）。胞核的形狀可以作為評(píng)估的參考，但受細(xì)胞退行性變和細(xì)胞分裂的影響較大。還有許多其它技術(shù)可以判定精液中白細(xì)胞群的數(shù)量。如比較流行的過(guò)氧化物酶染色鑒定多行核粒細(xì)胞特有的過(guò)氧化物酶，較適合初篩（Woff，1995；Johanlsson等，2000）（見(jiàn)2.18.1節(jié)）。白細(xì)胞也可以通過(guò)費(fèi)時(shí)并昂貴的免疫細(xì)胞化學(xué)方法來(lái)檢測(cè)評(píng)估，這種方法可以區(qū)分普通的白細(xì)胞和帶精子抗原的精子細(xì)胞（Homyk等,1990；Eggert-Kruse等，1992）（見(jiàn)3.2節(jié)）。正甲苯胺細(xì)胞過(guò)氧化物酶染色此方法快速廉價(jià)，較適合粒細(xì)胞初篩。原理一般經(jīng)過(guò)氧化物酶染色后的精液才行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，染色后可以比較容易的分辨粒細(xì)胞（圖2.14）。此項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)就是染色相對(duì)快捷，但也不能檢測(cè)：已經(jīng)活化并已釋放其顆粒的多形核白細(xì)胞；不含過(guò)氧化物酶的其它種類的白細(xì)胞，如：淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等。這種方法可以很好的分辨帶分葉核的中性粒細(xì)胞和多核的精子細(xì)胞，多核精子細(xì)胞本身不含過(guò)氧化物酶（Johanlsson等，2000）。下列檢測(cè)試劑和設(shè)備均較易購(gòu)得（Nahoum和Cardozo,1980）。試劑磷酸鹽緩沖液，67mmol/1,pH值6.0：9.47gNa2HPO4溶于1000ml純水和9.08gKH2PO4溶于1000ml純水?；旌蟽梢?，調(diào)pH值至6.0（大約12mlNa2HPO4溶液混于88mlKH2PO4溶液中）。飽和NH4C1溶液：250gNH4C1溶于1000ml純水。148mmol/lNa2EDTA液：每1000ml磷酸鹽緩沖液中加50gNa2EDTA。正甲苯胺液：2.5mg正-甲苯胺溶于10mlDNS。30%過(guò)氧化氫（H2O2）。工作液：以上9ml正甲苯胺液加1ml飽和NH4C1溶液、1ml148mmol/lNa2EDTA液、10pl30%過(guò)氧化氫混勻。此溶液配制后可使用24小時(shí)。注：國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（ARC,1962）已聲明，正甲苯胺實(shí)際上應(yīng)視作對(duì)人類有致癌的危險(xiǎn)。應(yīng)用時(shí)應(yīng)做防護(hù)（見(jiàn)附錄2）。步驟混勻精液標(biāo)本（見(jiàn)框2.3）。將0.1ml精液與0.9ml工作液混合。振蕩搖勻10秒，室溫孵育20-30分鐘。重復(fù)以上操作，制作第二份過(guò)氧化物酶染色標(biāo)本，注意需在加液前先重新混勻精液標(biāo)本。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)池評(píng)估計(jì)算過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目孵育20-30分鐘后重新混勻精子懸液，制備的兩份標(biāo)本分別血細(xì)胞計(jì)數(shù)池評(píng)估。將血細(xì)胞計(jì)數(shù)池平放于室溫保持計(jì)數(shù)板濕潤(rùn)（防止風(fēng)干）至少4分鐘，以便精子及細(xì)胞散布均勻。以相差顯微鏡X200或X400倍觀察。為達(dá)到最低樣本誤差，兩份涂片至少各觀察200個(gè)過(guò)氧化物酶染色陽(yáng)性的細(xì)胞（見(jiàn)框2.7和表2.2）。過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞被染為棕色，過(guò)氧化物酶陰性細(xì)胞不著色（見(jiàn)圖2.14）。按計(jì)數(shù)池中方格依次觀察并計(jì)數(shù)至少200個(gè)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞，應(yīng)將計(jì)數(shù)池中所有方格都觀察到，不得遺漏。6．將計(jì)數(shù)池中的計(jì)數(shù)方格編號(hào)，另一張涂片也要計(jì)數(shù)相同編號(hào)方格中的過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞至少200個(gè)。7．應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目及計(jì)數(shù)方格數(shù)目。8．同法觀察第二張涂片，注意按第一張涂片相同計(jì)數(shù)方格計(jì)數(shù)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞（可能此計(jì)數(shù)方格過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不足200個(gè)）。9．統(tǒng)計(jì)兩張涂片過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)和差值。10.查表得知可接受的樣本誤差率（見(jiàn)表2.5、圖A7.1、附錄7）。11．如果樣本誤差可接受，計(jì)算密度（見(jiàn)節(jié)）。如果樣本誤差太高取樣重做兩張涂片重新評(píng)估（見(jiàn)框2.10）。12.按兩張涂片過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞平均密度出報(bào)告。13.計(jì)算每次射出精液過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)（見(jiàn)節(jié)后注釋）。圖2.14人精液中過(guò)氧化物酶陽(yáng)性和過(guò)氧化物酶陰性細(xì)胞過(guò)氧化物酶陽(yáng)性粒細(xì)胞（標(biāo)記為P,染為棕色），過(guò)氧化物酶陰性圓細(xì)胞（標(biāo)記為N）。圖中標(biāo)尺為10pm。PN?精液中過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞密度的計(jì)算精液中過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞密度為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目(N)除以計(jì)數(shù)方格所占的容積(每一計(jì)數(shù)方格的容積為100n1,計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)以n表示)，再乘以稀釋比。如為1:10稀釋，密度為C=(N/n)X(1/100)X10=(N/n)X(1/10),單位：個(gè)/nl(X106個(gè)/ml)。評(píng)估每張計(jì)數(shù)池的9個(gè)計(jì)數(shù)方格后，過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)除以兩張計(jì)數(shù)池的總?cè)莘e(1.8p1),乘以稀釋比(10)也能得到精液中過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞密度，單位：個(gè)/pl(X103個(gè)/ml)。注：此方法也可應(yīng)用于圓細(xì)胞密度的計(jì)算，只是圓細(xì)胞總數(shù)(包括過(guò)氧化物酶陽(yáng)性和陰性細(xì)胞)用公式中的N表示。本方法的敏感度如果每張計(jì)數(shù)池中過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于200個(gè)，樣本誤差大于5%。如果兩張計(jì)數(shù)池中所有計(jì)數(shù)方格中過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于400個(gè)，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)報(bào)告樣本誤差(見(jiàn)表2.2)。如每張計(jì)數(shù)池中過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于25個(gè)，密度V277000/ml；應(yīng)用改良紐鮑爾計(jì)數(shù)池，按1:10稀釋后，評(píng)估所有9個(gè)計(jì)數(shù)方格的誤差下限為20%，此結(jié)果低于樣本誤差下限(Cooper等，2006)。報(bào)告時(shí)應(yīng)注明“細(xì)胞數(shù)目過(guò)少，無(wú)法達(dá)到精確評(píng)估濃度(V277000/ml)”。注釋：如標(biāo)本取樣部分評(píng)估未見(jiàn)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞，并不絕對(duì)意味著剩余標(biāo)本不含過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞。示例例1：1:10稀釋后涂片，涂片1觀察9個(gè)計(jì)數(shù)方格發(fā)現(xiàn)60個(gè)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞，涂片2觀察9個(gè)計(jì)數(shù)方格發(fā)現(xiàn)90個(gè)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞。18個(gè)觀察計(jì)數(shù)方格過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)150個(gè)(60+90)，樣本誤差為30(90-60)。由表2.5查得樣本誤差超出隨機(jī)誤差(24)，故本次結(jié)果不可取，需重新涂片計(jì)數(shù)評(píng)估。例2：1:10稀釋后涂片，涂片1觀察5個(gè)計(jì)數(shù)方格發(fā)現(xiàn)204個(gè)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞，涂片2觀察5個(gè)計(jì)數(shù)方格發(fā)現(xiàn)198個(gè)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞。10個(gè)觀察計(jì)數(shù)方格過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)402個(gè)(204+198)，樣本誤差為6(204-198)。由表2.5查得樣本誤差在隨機(jī)誤差以內(nèi)(39)，故本次結(jié)果可取。樣本中過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞密度為C=(N/n)X(1/10)=(402/10)X(1/10)=4.02/nl(4.02X106個(gè)/ml)。例3：1:10稀釋后涂片，涂片1觀察9個(gè)計(jì)數(shù)方格發(fā)現(xiàn)144個(gè)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞，涂片2觀察9個(gè)計(jì)數(shù)方格發(fā)現(xiàn)162個(gè)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞。18個(gè)觀察計(jì)數(shù)方格過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)306個(gè)(144+162)，樣本誤差為18(162-144)。由表2.5查得樣本誤差在隨機(jī)誤差以內(nèi)(34)，故本次結(jié)果可取。樣本中過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞密度為C=(N/1.8)X10=(306/1.8)X10=1700/”l(1.7X106/ml)。因?yàn)橛?jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于400,故報(bào)告時(shí)應(yīng)著明樣本誤差(約6%、見(jiàn)表2.2)。例4：1:10稀釋后涂片，涂片1觀察9個(gè)計(jì)數(shù)方格未發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞，涂片2觀察9個(gè)計(jì)數(shù)方格發(fā)現(xiàn)少于25個(gè)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞，密度V277000/ml；報(bào)告時(shí)應(yīng)注明“細(xì)胞數(shù)目過(guò)少，無(wú)法達(dá)到精確評(píng)估濃度(V277000/ml)”。參考值目前沒(méi)有正?？缮行跃哼^(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞密度統(tǒng)計(jì)。本手冊(cè)推薦1.0X106/ml作為參考值。注釋1:每次射精過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)可能受炎癥影(Wolff,1995)?？倲?shù)由過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞濃度乘每次射精量得來(lái)。注釋2:正常生育男性過(guò)氧化物酶陽(yáng)性多形核白細(xì)胞參考低值為X106/ml-1.0Xl06/ml,白細(xì)胞參考值為0X106/ml-2.0Xl06/ml(Wolff,1995)。前一版本的手冊(cè)將1.0X10伽1作為精液白細(xì)胞的臨界值基于一些影響因素如精液質(zhì)量，IVF結(jié)果，細(xì)菌感染，活性氧類對(duì)精子的影響，有些研究認(rèn)為此臨界值設(shè)置得太低(Woff1995)，另外一些研究認(rèn)為此臨界值設(shè)置的太(Sharma等,2001;Punab等,2003)。注釋3:每次射精精液中白細(xì)胞數(shù)目超標(biāo)可能與精子質(zhì)量有關(guān)。注釋4:精液中白細(xì)胞對(duì)精子造成的損傷程度與精液中白細(xì)胞總數(shù)及白細(xì)胞與精子數(shù)目比例有關(guān)。注釋5:白細(xì)胞通過(guò)氧化作用對(duì)精子的活力和NA完整性有損害(見(jiàn).1部分)。但是，觀察到的白細(xì)胞浸潤(rùn)引起的損害程度是否依賴于單一標(biāo)本中的某些因素，還是不確定的。這些影響因素包括白細(xì)胞浸潤(rùn)時(shí)機(jī)或位置還，有白細(xì)胞種類或白細(xì)胞活性等Tomlinson等,1993;Aitken和Baker,1995;Rossi和Aitken,1997)。(山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心梁明譯)2.19分析精液中的未成熟生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞包括：圓形精子細(xì)胞、精母細(xì)胞，但僅含有少量的精原干細(xì)胞。精液涂片染色后可檢出上述細(xì)胞，但它們降解后很難與炎癥細(xì)胞區(qū)別?？赏ㄟ^(guò)巴氏染色將精子和精原母細(xì)胞與白細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)（Johanissonetal.,2000，見(jiàn)2.14.2節(jié)）。可根據(jù)染色的顏色、核的大小、顏色（見(jiàn)2.18節(jié)），無(wú)細(xì)胞內(nèi)白細(xì)胞過(guò)氧化物酶、無(wú)白細(xì)胞特異性抗原（見(jiàn)3.2節(jié)）多核精子細(xì)胞與多核白細(xì)胞在形態(tài)上難以區(qū)分。但染色后精子細(xì)胞呈淡紅色而PMN白細(xì)胞呈藍(lán)色（Johanissonetal.,2000）?？梢罁?jù)發(fā)育中頂體的特異性染色（Coutureetal.,1976）、凝集素（見(jiàn)4.4.1節(jié)）和特異的抗體（Homyketal.,1990;Ezehetal.,1998）鑒別出圓形精子。核的大小也有助于分類：精原干細(xì)胞（精液中很少見(jiàn)）核約8pm，精母細(xì)胞核約10pm，精子細(xì)胞核約5pm?？紤]到降解和分裂可能影響核的大小，上述給出的數(shù)據(jù)僅供參考。2.20精子包被的抗體的檢測(cè)如果精子出現(xiàn)凝集（如活動(dòng)精子彼此間出現(xiàn)頭對(duì)頭、尾對(duì)尾或者頭尾混和，見(jiàn)2.4.4節(jié)）則提示可能有抗精抗體的存在。注釋1：抗精子抗體存在時(shí)精子并不一定表現(xiàn)為凝集；同樣的，抗精子抗體的存在并不是凝集現(xiàn)象出現(xiàn)的唯一原因。注釋2：僅有少量抗精子抗體的存在不能作為診斷精子自身免疫疾?。╬ermautoimmunity）充足依據(jù)。只有經(jīng)過(guò)精子宮頸粘液穿透試驗(yàn)證明當(dāng)抗體的存在嚴(yán)重影響精子功能時(shí)才能作出上述診斷。精液中的抗精子抗體（ASAb）幾乎全部屬于兩類免疫球蛋白：IgA和IgG。由于體積較大，IgM抗體在精液中很少出現(xiàn)。IgA抗體的臨床意義大于IgG抗體（Kremer&Jager,1980）。通過(guò)相關(guān)的篩查試驗(yàn)從精子或體液中檢測(cè)到上述兩種抗體。精子抗體的檢測(cè)（直接檢測(cè)）在此推薦兩種直接檢測(cè)方法：混合抗球蛋白凝集試驗(yàn)（MAR）（綜述見(jiàn)Bronsonetal.,1984）免疫球試驗(yàn)（IB）（Bronsonetal.,1982;Clarkeetal.,1982,1985）。MAR使用的是新鮮精液而免疫珠使用洗滌后的精液。兩種檢測(cè)方法不一定能得到相同的結(jié)果（Scarsellietal.,1987;MacMillan&Baker,1987;Meinertz&Bronson,1988;Hellstrometal.,1989），而對(duì)于那些沒(méi)有活動(dòng)精子的標(biāo)本，IB可檢測(cè)精漿中是否有抗精子抗體存在。盡管IB和MAR的操作過(guò)程不太一樣，但它們最后都必須使用顯微鏡觀測(cè)待測(cè)的精子和小珠。小珠與那些表面含有抗體的活動(dòng)和不動(dòng)的精子結(jié)合；被小珠粘住的活動(dòng)精子占活動(dòng)精子的百分?jǐn)?shù)應(yīng)被記錄下來(lái)。檢測(cè)沒(méi)有精子的體液（如精漿、血清或可溶解的宮頸粘液）中是否含有抗精子抗體（間接免疫法）。在這些檢測(cè)中，若某種體液被懷疑可能存在抗精子抗體，可將它稀釋后經(jīng)加熱滅活，與經(jīng)直接法檢測(cè)證實(shí)不含抗體的捐獻(xiàn)精子（事先經(jīng)洗滌除去精漿）共孵育。為了確保結(jié)果的可信度，必須使精子與抗體有足夠的相互作用時(shí)間。因?yàn)橹辽傩枰?0分鐘的反應(yīng)時(shí)間才能觀察到混合物發(fā)生的凝集。然而，必須銘記的是，精子的活動(dòng)力隨反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)而下降，而檢測(cè)結(jié)果的判讀又需要足夠的活動(dòng)精子。注1：兩種ASAb檢測(cè)試劑盒都有商品提供。但它們都必須在有活動(dòng)精子的情況下檢測(cè)。當(dāng)活動(dòng)精子較少時(shí)，可選擇間接法檢測(cè)精漿或血清中的抗精抗體。注2：在這些檢測(cè)中，抗體的細(xì)胞毒性可能會(huì)殺死所有的精子或抑制精子的活動(dòng)力。操作將精液標(biāo)本充分混勻。（見(jiàn)框2.3）重復(fù)取出幾滴精液（每滴3.5卩1）,分別置于不同的載玻片上。每張玻片同時(shí)加入一滴ASAb陽(yáng)性精液和一滴ASAb陰性精液（3.5卩1）作為每個(gè)檢測(cè)的內(nèi)參。作為對(duì)照的精液應(yīng)來(lái)自：①那些已知攜帶\沒(méi)有攜帶抗精抗體的男性;②它們?cè)谙惹暗腗AR試驗(yàn)中被證實(shí)含有\(zhòng)未含有抗精抗體的標(biāo)本。此外，將精子與已知含有抗體的精漿共孵育也可得到用做對(duì)照的陽(yáng)性精子（見(jiàn)2.20.3節(jié)）。將3.5卩1含有包被有IgG的膠乳顆粒（小珠）的試劑分別加待測(cè)標(biāo)本及對(duì)照物中，并用加樣槍混勻。將3.5卩1含有包被有IgG抗血清試劑分別加待測(cè)標(biāo)本及對(duì)照物中，并用加樣槍混勻。蓋上蓋玻片（22mmx22mm），使懸液保持約20pm的深度（見(jiàn)框2.4）。將玻片在濕盒中室溫水平放置三分鐘（例如可以放在一個(gè)合蓋的皮氏培養(yǎng)皿中，同時(shí)放入吸滿水的濾紙），以避免前述懸液被蒸發(fā)干。三分鐘后，在放大倍數(shù)為X200或X400相差顯微鏡中觀察濕片；10分鐘后再觀察一次。使用IgA的試劑重復(fù)上述步驟檢測(cè)相應(yīng)的抗體是否存在。評(píng)分如果精子表面含有抗體，乳膠珠將會(huì)粘附在上面。最初，可觀察到活動(dòng)精子帶著幾顆或者一小簇乳膠顆粒四處游蕩。最后，凝集塊越來(lái)越大，最后精子的活動(dòng)也因此變得很困難。而沒(méi)有抗體的精子在顆粒間自由游動(dòng)。檢測(cè)的目的是判斷被小珠粘附的活動(dòng)精子占總活動(dòng)精子百分率。最常見(jiàn)的假陽(yáng)性精子就是精子與小珠很靠近，但實(shí)際上并未與之粘附在一起。為了確定精子是否與珠子發(fā)生粘附可以用一個(gè)小槍頭輕敲蓋玻片，珠子發(fā)生漂移，而真正的粘附就很容易被辨別出來(lái)。僅計(jì)數(shù)活動(dòng)的精子，算出至少被兩粒小珠粘附的活動(dòng)精子占總活動(dòng)精子數(shù)的百分比。不計(jì)數(shù)尾尖被粘附的情況。為了獲得可接受的低樣本誤差，每次至少計(jì)數(shù)200條活動(dòng)精子（見(jiàn)框2.5）。計(jì)算出被粘附的活動(dòng)精子占總活動(dòng)精子數(shù)的百分率。計(jì)錄檢測(cè)抗體的種類及精子被小珠粘附的具體位置（頭部、中部和尾部）。忽略尾尖被粘附的情況。注1：如3分鐘時(shí)觀察100%的活動(dòng)精子被免疫珠附著，那此結(jié)果即為最終結(jié)果不用10分鐘時(shí)重復(fù)觀察。注2：如3分鐘時(shí)觀察不是100%的活動(dòng)精子被免疫珠附著，那需10分鐘時(shí)重復(fù)觀察。注3：如10分鐘時(shí)觀察未見(jiàn)活動(dòng)精子，那以3分鐘時(shí)觀察結(jié)果作為最終結(jié)果。參考值目前暫時(shí)沒(méi)有正常生育男性精子MAR實(shí)驗(yàn)參考值。在有更多參考值以前，本手冊(cè)將50%活動(dòng)精子有顆粒附著作為閾值。注釋：當(dāng)50%或更多的活動(dòng)精子被小珠粘附時(shí)精子宮頸粘液穿透能力和VF受精率可能受影^iAbshagenetal.,1998）。但若只有尾尖被粘附的情況也出現(xiàn)在生育力正常的男性中，不影響生育力(hiu&Chamley,2004)。直接免疫珠試驗(yàn)這項(xiàng)檢測(cè)比MAR費(fèi)時(shí)，但I(xiàn)B中精子經(jīng)過(guò)洗滌，除去了精漿中可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響的物質(zhì)。在直接免疫珠試驗(yàn)(IB)中，共價(jià)連接有兔抗人免疫球蛋白IgG/IgA的小珠與洗過(guò)的精子直接混合。活動(dòng)精子與IgG/IgA小珠粘附在一起提示精子表面含有IgG/IgA抗體。試劑杜氏(Dulbecco's)葡萄糖磷酸鹽緩沖液(PBS)牛血清白蛋白(BSA)或臺(tái)氏(Tyrode's)BSA溶液：見(jiàn)附件4，A4.2節(jié)及A4.9節(jié)。緩沖液I：加入0.3克CohnFractionVBSA至100克杜氏(Dulbecco's)PBS或臺(tái)氏培養(yǎng)基(Tyrode'smedium)。緩沖液II：加入5克CohnFractionVBSA至100ml杜氏(Dulbecco's)PBS或臺(tái)氏培養(yǎng)基(Tyrode'smedium)。使用0.45屮m孔徑的濾膜過(guò)濾上述所有溶液，使用前復(fù)溫至25-35°C。免疫珠的準(zhǔn)備使用前每種免疫珠(IgGIgA)各取0.2ml小珠懸液貯存液加入含10ml緩沖液I的離心管中。500g或600g離心5-10分鐘。除去上清。在0.2ml的緩沖液II中輕輕重懸小珠。精子的準(zhǔn)備一次試驗(yàn)中所需要的精液的量根據(jù)精子的密度和活動(dòng)力而定。(見(jiàn)表2.7)。表2.7一次免疫珠試驗(yàn)中需要用到的精液量精子密度(106/ml)精子活動(dòng)力(PR)(%)需要的精液體積(ml)>50-0.221-50>400.421-50<40>100.810-20>401.010-20<40>102.0<10>5>10>2.01.充分混勻每個(gè)精液標(biāo)本(見(jiàn)框2.3)。將相應(yīng)的精液量吸入離心管，加緩沖液I至10ml。3.500g離心5-10分鐘。4.除去上清。加入10ml新鮮的緩沖液II,輕輕的反復(fù)吹打，使精子重懸。500g離心5-10分鐘。除去上清。8.將精子沉淀輕輕地重懸于0.2ml的緩沖液II中。注1：如果精液量超過(guò)1.0ml，需要洗滌三次。注2：精子活動(dòng)力低的標(biāo)本(如低于10%)可能難以得到清晰的結(jié)果，此時(shí)考慮使用間接免疫珠法。(見(jiàn)2.20.3節(jié))步驟在每個(gè)檢測(cè)中，必須同時(shí)含有ASAb-陽(yáng)性的精子和ASAb-陰性的精子作為對(duì)照。上述精液必須來(lái)自已被之前的直接免疫珠試驗(yàn)證明含有/未含有抗精抗體的男性。將5卩1洗過(guò)的精子懸液加入載玻片。在另外兩張載玻片上分別加入5plASAb-陽(yáng)性精子和5plASAb-陰性精子。向每個(gè)精液小滴中加入5卩1抗IgG免疫珠懸液。用槍頭輕輕地混勻抗IgG免疫珠和精液。將22mmx22mm蓋玻片蓋在每個(gè)小滴上，使每個(gè)小滴的深度在20pm左右（見(jiàn)框2.4）。將載玻片水平放置于一個(gè)濕盒中，室溫反應(yīng)3-10分鐘（如可以將浸水的吸水紙放入皮氏皿中制成濕盒）。等待閱片的時(shí)間不要超過(guò)10分鐘。因?yàn)樵诜跤倪^(guò)程中，與免疫珠的結(jié)合可顯著降低精子的活動(dòng)力。用放大倍數(shù)為X200或x400的相差顯微鏡讀片。只計(jì)數(shù)被一粒或多粒免疫珠結(jié)合的活動(dòng)精子。參見(jiàn)節(jié)，忽略尾尖被粘附的情況。結(jié)果的解釋見(jiàn)節(jié)。使用抗IgA免疫珠懸液重復(fù)上述操作。注：為了保證所有的結(jié)合都能在10分鐘之內(nèi)被檢測(cè)到，在制備玻片時(shí)需要反復(fù)搖晃載玻片。參考值目前對(duì)于IB檢測(cè)，尚無(wú)抗體結(jié)合的正常參考值。由于缺乏新的證據(jù)，本手冊(cè)仍保留之前公認(rèn)的“50%活動(dòng)精子被粘附”作為閾值。注釋：當(dāng)有50%或更多的活動(dòng)精子（前向運(yùn)動(dòng)或非前向運(yùn)動(dòng)）被顆粒粘附時(shí)即可診斷免疫性不育（Barrattetal.,1992）。當(dāng)顆粒與尾尖結(jié)合時(shí)并不影響生育力。這種情況也出現(xiàn)在生育率正常的男性中Chiu&Chamley,2004）。間接免疫珠試驗(yàn)間接免疫珠試驗(yàn)被用于檢測(cè)那些熱失活或無(wú)精子體液（血清、睪丸液、精漿或菠蘿蛋白酶-溶解的宮頸粘液）。在間接免疫珠試驗(yàn)中，通過(guò)使無(wú)抗體的供者精子帶上待測(cè)體液中的抗精子抗體來(lái)達(dá)到檢測(cè)目的。試劑見(jiàn)（同直接IB試驗(yàn)）。如果待測(cè)體液是宮頸粘液，需準(zhǔn)備濃度為10IU/ml的菠蘿蛋白酶（EC2）（見(jiàn)框2.2）。這是一種低特異性的蛋白水解酶。免疫珠的準(zhǔn)備見(jiàn)。供者精子的準(zhǔn)備見(jiàn)。待測(cè)體液的準(zhǔn)備1.如果待測(cè)體液是宮頸粘液，用10IU/ml的菠蘿蛋白酶以1+1（1:2）比例混合，用槍頭混勻，37°C孵育10分鐘。當(dāng)完全液化后以2000g離心10分鐘。使用上清液用于檢測(cè)，或凍存于-70°C。將溶解的宮頸粘液、血清、精漿或睪丸液56°C加熱30-45分鐘，以達(dá)到滅活。以1+4（1:5）比例將滅活的標(biāo)本與緩沖液II混合。（例如10卩1體液與40卩1的緩沖液II混合）。檢測(cè)時(shí)必須帶有已知的陽(yáng)性和陰性標(biāo)本作為對(duì)照。例如，可使用那些已知含有或未含有抗精子抗體的男性血清。相應(yīng)的，這些作為對(duì)照的標(biāo)本事先必須通過(guò)間接免疫珠試驗(yàn)證實(shí)是否含有抗精子抗體。當(dāng)輸精管切除者的血清呈陽(yáng)性時(shí)，可用作陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)本的來(lái)源。（陽(yáng)性是指>50%的活動(dòng)精子被粘附，排除尾尖被粘附的情況）。將供者精子與待測(cè)標(biāo)本共孵育1.將待測(cè)體液以1+4（1:5）的比例稀釋。再將50卩1洗過(guò)的供者精子與50卩1稀釋好的體液混勻。2.37°C孵育1小時(shí)。500g離心5-10分鐘。棄上清。輕輕地用10ml新配制的緩沖液I重懸精子沉淀。500g離心5-10分鐘。棄上清。重復(fù)步驟5，6，7。輕輕地用0.2ml的緩沖液II重懸精子沉淀。免疫珠檢測(cè)使用與待測(cè)體液孵育過(guò)的供者精子，根據(jù)的描述進(jìn)行免疫珠（IB）檢測(cè)。評(píng)分和結(jié)果解釋參見(jiàn)節(jié)及節(jié)。（盧慧譯）第3章可選檢測(cè)本章所述的操作在常規(guī)的精液檢測(cè)中是非必需的，但在某些情況下有助于診斷和科研。3.1精子多重缺陷的指標(biāo)精子形態(tài)學(xué)異常的情況常常表現(xiàn)為多方面的異常同時(shí)發(fā)生(頭部、中部、尾部或上述異常同時(shí)發(fā)生。)詳細(xì)評(píng)價(jià)各種異常發(fā)生的頻率遠(yuǎn)比單純計(jì)算正常精子的百分率更有意義；特別是當(dāng)涉及研究人類生精功能損傷情況時(shí)Jouannetetal.,1988;Augeretal.,2001)。記錄形態(tài)正常精子的同時(shí)記錄異常是發(fā)生在頭部、頸部、尾部，用這種多元評(píng)價(jià)體系(multiple-entrysystem)可計(jì)算出平均每個(gè)精子的異常值。這種評(píng)價(jià)精子畸形發(fā)生詳細(xì)位點(diǎn)(頭部、頸部或尾部)的多元評(píng)價(jià)系統(tǒng)包括三種指標(biāo)：多重異常指數(shù)(themultipleanomaliesindex，MAI)(Jouannetetal.,1988);畸形精子指數(shù)(theteratozoospermiaindex，TZI)(Menkveld&Kruger,1996;Menkveldetal.,2001);精子畸形指數(shù)(thespermdeformityindex，SDI)(Azizetal.,1996,2004)；其中MAI和TZI與體內(nèi)受精有關(guān)Jouannetetal.,1988;Slamaetal.,2002;Menkveldetal.,2001)。SDI與體外受精有關(guān)(Azizetal.,1996)。此外，這些指標(biāo)在評(píng)價(jià)一些病理或有毒有害環(huán)境對(duì)生育力影響時(shí)也十分有用(Augeretal.,2001;Azizetal.,2004)。3.1.1多重畸形指數(shù)的計(jì)算從頭部、頸部、尾部和是否有殘留的過(guò)大的胞漿小滴(當(dāng)它的體積超過(guò)精子頭部的1/3時(shí))幾個(gè)方面來(lái)評(píng)價(jià)精子是否存在缺陷。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)器所需要使用的鍵的數(shù)目應(yīng)該根據(jù)需要評(píng)價(jià)的指標(biāo)數(shù)而定。如果沒(méi)有計(jì)數(shù)器，則可以使用評(píng)分表。MAI是每個(gè)精子出現(xiàn)異常數(shù)的平均值。所有的頭部、頸部和尾部的畸形都應(yīng)計(jì)算在內(nèi)。與本手冊(cè)的其它評(píng)價(jià)體系不同（見(jiàn)2.15.1節(jié)和2.15.2節(jié)），該指數(shù)所使用的形態(tài)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)采用由David等（1975）提出，經(jīng)Auger和Eustache（2000）修正的評(píng)價(jià)體系。TZI與MAI相似，二者的區(qū)別在于TZI只記錄每個(gè)精子的四種缺陷：頭部、頸部、尾部及是否含有過(guò)大的殘留胞漿小滴，而不去記錄是否還存在有其它方面的異常。該指數(shù)采用本手冊(cè)所推薦的形態(tài)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。SDI由缺陷的數(shù)目除以總精子數(shù)（而非只是異常精子數(shù)）。該指數(shù)可記錄多種精子頭部異常的情況，但頸部和尾部的缺陷僅作一次記錄。該指數(shù)采用本手冊(cè)所推薦的形態(tài)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。表3.1各種精子畸形指數(shù)的計(jì)算MAITZI*SDI最大值43分母異常精子異常精子所有精子（A）計(jì)數(shù)的精子數(shù)目200200200正常精子（N）464646正常精子（％）232323（B）發(fā)生缺陷的精子總數(shù)（200-46）154154154（1）頭部缺陷（MAI，SDI）精子總數(shù)或精子頭部缺陷指數(shù)三1（TZI）284154212（2）頸部缺陷（MAI）精子總數(shù)或精子頭部缺陷指數(shù)三1（TZI,SDI）545252（3）尾部缺陷（MAI）精子總數(shù)或精子頭部缺陷指數(shù)三1（TZI,SDI）544646（4）胞漿小滴殘留過(guò)多的精子141414(C)總MAI值：(1)+(2)+(3)=(C)392(D)總TZI,SDI：(1)+(2)+(3)+(4)=(D)266324指標(biāo)的計(jì)算公式C/BD/BD/A指標(biāo)值2.551.721.62*這里對(duì)TZI的描述是根據(jù)以下文獻(xiàn)：原始論文Menkveldetal.,2001)、歐洲人類生殖與胚胎手冊(cè)(EuropeanSocietyofHumanReproductionandEmbryology,ESHRE)以及北歐男科學(xué)會(huì)^NordicAssociationforAndrology,NAFA)(ESHRE/NAFA,2002)。與本手冊(cè)之前的版本W(wǎng)HO,1999)不同，前述文獻(xiàn)給出的正常參考范圍是：1~4。后者是將殘余的胞漿小滴計(jì)入頸部畸形，且TZI的正常參考范圍為1~3。3.1.2示例例：使用六鍵計(jì)數(shù)器每次計(jì)數(shù)200條精子。在第1次計(jì)數(shù)時(shí)，42條正常158條異常。在158條異常精子中，140條有頭部缺陷，102條有頸部缺陷，30條有尾部缺陷，44條有多余的胞漿小滴殘留。在第2次計(jì)數(shù)時(shí)，36條正常，164條異常。其中122條有頭部畸形，22條頸部畸形，36條有多余的胞漿小滴。計(jì)算TZI時(shí)，用總的畸形數(shù)(140+102+30+44+122+108+22+36=604畸形)除以異常精子數(shù)(158+164=322),i.e.TZI=604/322=1.88。

表3.2不育夫婦和生育力正常夫婦的精子缺陷指標(biāo)不育夫婦生育力正常夫婦MAIiTZI2MAI3TZI2均值1.941.811.581.51SD0.3最低值1.121.261.041.17最高值3.92.642.382.07Centile51.441.27101.511.741.341.33251.671.44501.881.811.581.54752.141.72902.441.86952.651.94N49301039441071?未出版的數(shù)據(jù)來(lái)JAuger,Paris，使用的是David形態(tài)分類法Davidetal.,1975,由Auger&Eustache修改2000)o2.Menkveldetal.,2001。3Jorgensenetal,2001,使用的是David形態(tài)分類法(Davidetal.,1975,由Auger&Eustache修改,2000)。已經(jīng)釋放了粒細(xì)胞的多形核白細(xì)胞和不含過(guò)氧化物酶的其它類型的白細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞不被為o-甲苯胺細(xì)胞過(guò)氧化試驗(yàn)檢測(cè)出來(lái)。(見(jiàn)2.18.1)但這些白細(xì)胞可被細(xì)胞免疫化學(xué)的方法檢測(cè)出來(lái)。盡管細(xì)胞免疫化學(xué)染色的方法比檢測(cè)白細(xì)胞過(guò)氧化物酶的方法更費(fèi)時(shí)費(fèi)錢(qián)，但它在區(qū)別白細(xì)胞與生精細(xì)胞的時(shí)候更有意義。3.2.1原理所有種類的人白細(xì)胞均表達(dá)一個(gè)特殊的抗原（CD45）,它可被相應(yīng)的單克隆抗體檢測(cè)出來(lái)。通過(guò)改變一抗的特性，這個(gè)常規(guī)的檢測(cè)方法可用于檢測(cè)各種感興趣的白細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B-細(xì)胞或T-細(xì)胞。3.2.2試劑杜氏PBS（DPBS）：見(jiàn)Appendix4,sectionA4.2。Tris-緩沖液（TBS），pH8.2；見(jiàn)Appendix4,sectionA4.8。四咪唑-HC1（左旋咪唑）：1.0ml/l：將2.4g左旋咪唑溶解于10ml純水中。底物：向9.7ml的TBS（pH8.2）中加入2mg的萘酚AS-MX磷酸、0.2ml二甲基甲酰胺以及0.1mll.0mol/l的左旋咪唑。使用前加入10mg快紅（fastredTRsalt）并過(guò)濾（0.45-ym孔徑）。固定：?jiǎn)斡帽虮?甲醇/甲醛：95ml丙酮加入95ml純甲醇、10ml37%（v/v）甲醛。一抗：鼠抗普通白細(xì)胞抗原（編碼CD45）的單克隆抗體。二抗：鼠抗兔免疫球蛋白。根據(jù)抗體的滴度及來(lái)源選擇稀釋劑。堿性磷酸酶：抗堿性磷酸酶復(fù)合物（APAAP）。Harris's蘇木精染液（作于復(fù)染）：見(jiàn)Appendix4,sectionA4.10。3.2.3步驟精液的準(zhǔn)備充分混勻精液（見(jiàn)框2.3）。將一滴約0.5ml的精液與約五倍體積的DPBS混合。500g離心5分鐘，除去上清，將精子沉淀重懸于5倍體積的DPBS。500g離心5分鐘。重復(fù)這一操作一遍并將精子沉淀重懸于DPBS中，使終密度達(dá)到50X106/ml。精子涂片的準(zhǔn)備分別在兩張清潔的玻片上滴加5卩1精子懸液并制成涂片(見(jiàn)Section2.13.2)并自然晾干。固定風(fēng)干的細(xì)胞：純丙酮固定10分鐘或丙酮/甲醇/甲醛固定90秒。用TBS染兩次后自然晾干。處理后的玻片可直接染色或用鋁箔包裹后置于-70°C冰箱待用。抗體孵育在每張玻片上用油性筆標(biāo)記出固定細(xì)胞的位置(一個(gè)約1cm直徑的圈)，并在上