生化藥物與基因工程藥物的分析

第五章

生化藥物和基因工程藥物的分析1醫(yī)學課件ppt1、了解生化藥物、基因工程藥物的定義、種類。2、熟悉質(zhì)量檢驗的基本程序與方法。3、掌握生化藥物、基因工程藥物的特點及常用的化學定量分析方法。本章學習要點2醫(yī)學課件ppt人類用于預防、治療和診斷疾病的三大主要藥物第一節(jié)概述化學藥物生物藥物中藥3醫(yī)學課件ppt生物藥物的分類：生化藥物生物技術藥物生物制品從生物體分離純化制得的生化基本物質(zhì)，以及用化學合成、微生物合成或現(xiàn)代生物技術制得的一類藥物。利用生物體或其組成部分發(fā)展產(chǎn)品的技術體系即現(xiàn)代生物技術研制的藥物稱之。應用普通的或基因工程、細胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術獲得的微生物、細胞及各種動物和人源的組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病預防、治療和診斷的藥品。4醫(yī)學課件ppt一、生化藥物和基因工程藥物的定義1、生化藥物的定義從動物、植物及微生物提取的，也可用生物－化學半合成或用現(xiàn)代生物技術制得的生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物以及大分子的結構修飾物等。5醫(yī)學課件ppt2、基因工程藥物的定義先確定對某種疾病具有預防和治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制該蛋白質(zhì)合成過程的基因進行分離、純化或人工合成，利用重組DNA技術加以改造，最后將該基因?qū)肟梢源罅可a(chǎn)的受體細胞中不斷繁殖或表達，并能進行大規(guī)模生產(chǎn)具有預防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)，通過這種方法生產(chǎn)的藥物稱之。6醫(yī)學課件ppt1、氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類藥物二、生化藥物和基因工程藥物的種類（一）生化藥物的種類（1）氨基酸及其衍生物：①單氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、色氨酸、賴氨酸、甘氨酸等。7醫(yī)學課件ppt②氨基酸衍生物：N-乙酰-L-半胱氨酸、S-氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、谷胺酰胺、S-羥色氨酸。③復合氨基酸注射液：3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S復合氨基酸注射液。（S代表氨基酸的種類）8醫(yī)學課件ppt（2）多肽類藥物：①垂體多肽：促腎上腺皮質(zhì)激素、促胃液素、加壓素。②消化道多肽：促胰液素（胰泌素）、胃泌素、抑胃肽。③下丘腦多肽：促甲狀腺素釋放激素、促性腺激素釋放激素、生長激素釋放激素。9醫(yī)學課件ppt④腦多肽：由人及動物腦和腦脊液中分離出來的多肽、蛋氨酸腦啡肽和亮氨酸腦啡肽等。⑤激肽類：血管緊張肽I、II、III等活性肽。⑥其它肽類：谷脫甘肽、降鈣素、睡眠肽、松果肽、血活素（分子量為3000的肽為主成分)。10醫(yī)學課件ppt（3）蛋白類藥物豬或牛的纖維蛋白原、纖維蛋白、胃膜素（糖蛋白）、水蛭素、肝細胞生長因子；屬蛋白質(zhì)類激素尚有生長素、催乳素、促甲狀腺素、促泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）；植物來源的蛋白類藥物有植物凝集素、天花粉蛋白、蓖麻和相思豆毒蛋白等。11醫(yī)學課件ppt2、酶類藥物（1）助消化酶類：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、麥芽淀粉酶。（2）蛋白水解酶類：溶菌酶、胰DNA酶、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶。（3）凝血酶及抗栓酶：凝血酶（豬、牛血）、纖溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶。12醫(yī)學課件ppt（4）抗腫瘤酶類：L-天門冬酰胺酶、甲硫氨酸酶、組氨酸酶、谷氨酸胺酶。（5）其它酶類：細胞色素C、超氧化物歧化酶（SOD）、RNA酶、青霉素酶。（6）輔酶：CoA、黃素單核苷酸（FMN）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。13醫(yī)學課件ppt3、多糖類藥物（1）肝素、硫酸軟骨素A和C、硫酸皮膚素（硫酸軟骨素B）、硫酸角質(zhì)素、透明質(zhì)酸等。（2）類肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多糖、殼聚多糖、右旋糖苷、靈芝多糖、豬苓多糖、人參多糖、黃芪多糖等。14醫(yī)學課件ppt4、脂質(zhì)類藥物卵磷脂、腦磷脂、膽固醇、麥角固醇、B谷固醇、膽汁酸（膽酸與甘氨酸或牛黃酸的結合物）、鵝脫氧膽酸、膽紅素、原葉琳、血葉琳、亞油酸、花生四烯酸、五-六烯酸、前列腺素系列（PGE1、PGE2、PGE2a和PG12）。15醫(yī)學課件ppt5、核酸類藥物RNA（包括iRNA-免疫核糖核酸）、DNA（脫氧核糖核酸）、聚肌苷酸、巰基聚胞苷酸、cAMP、AMP、肌苷。此外，有核酪制劑，6-巰基嘌呤、6-硫代嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、5-碘苷和無環(huán)鳥苷等。16醫(yī)學課件ppt二、基因工程藥物的種類1、激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物（1）人生長激素釋放抑制因子（2）人胰島素（3）人生長激素17醫(yī)學課件ppt2、細胞因子類藥物（1）人干擾素（2）人白細胞介素（3）集落刺激因子（4）促紅細胞生長素18醫(yī)學課件ppt3、酶類及凝血因子類藥物單克隆抗體、疫苗、基因治療藥物、白介素、生長因子、反義藥物、腫瘤壞死因子等。19醫(yī)學課件ppt1、具有一定的生物活性或生理功能，能夠參與、影響和調(diào)控人體代謝和生理功能，對于某些疾病的治療具有針對性強、毒副作用小、易為人體所吸收等特點。三、生化藥物和基因工程藥物的特點20醫(yī)學課件ppt2、分子量不是定值除氨基酸、核苷酸、輔酶及甾體激素等屬化學結構明確的小分子化合物外，大部分為大分子物質(zhì)，其分子量一般幾千至幾十萬。對大分子的藥物而言，即使組分相同，往往由于分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性。21醫(yī)學課件ppt

3、結構確證難在此類藥物中，由于有效結構或分子量不確定，其結構的確證很難沿用元素分析、IR、UV、NMR、MS等方法加以證實，往往還要用生化法如氨基酸序列等法加以證實。22醫(yī)學課件ppt4、全過程的質(zhì)量控制此類藥物對熱、酸、堿、重金屬以及pH較敏感，需對原材料、生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品進行質(zhì)量控制。23醫(yī)學課件ppt5、生物活性檢查在制備多肽或蛋白質(zhì)類藥物時，有時因工藝條件的變化，導致蛋白質(zhì)失活。因此，除了用通常采用的理化法檢驗外：尚需用生物檢定法進行檢定，以證實藥物的生物活性。

24醫(yī)學課件ppt6、安全性檢查由于此類藥物性質(zhì)特殊，生產(chǎn)工藝復雜，易引入特殊雜質(zhì)和污染物，故常需做安全性檢查。25醫(yī)學課件ppt7、效價測定對酶類藥物需進行效價測定或酶活力測定，以表明其有效成分含量的高低。26醫(yī)學課件ppt第二節(jié)質(zhì)量檢驗的基本程序與方法

一、鑒別試驗（一）理化鑒別法

利用化學法、物理法及生物學方法來確證生化藥物的真?zhèn)巍Ｓ脴藴势坊驅(qū)φ掌吩谕粭l件下進行對照試驗。27醫(yī)學課件ppt1、化學反應法

通常利用藥物與某試劑在一定條件下反應，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進行鑒別。例如，溶菌酶的鑒別采用呈色法；胃蛋白酶的鑒別采用沉淀法。28醫(yī)學課件ppt2、HPLC法

高效液相色譜法:見后29醫(yī)學課件ppt3、UV法

三磷酸腺苷二鈉的分子中具有共軛系統(tǒng)，能吸收紫外光。本品的0.01mol／L鹽酸水溶液（20μg／ml），在（257±1）nm的波長處有最大吸收。A250nm／A260nm的值應為0.17～0.27。30醫(yī)學課件ppt（二）生化鑒別法

1、酶法：尿激酶是專屬性較強的蛋白水解酶，根據(jù)尿激酶能激活牛纖維蛋白溶酶原，而具有相同作用的鏈激酶不能激活牛纖維蛋白溶酶原而加以區(qū)別，并用直接觀察溶解纖維蛋白作用的氣泡上升法作為判斷指標。

31醫(yī)學課件ppt2、電泳法肝素的鑒別采用糖凝膠電泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子間組成的酸性粘多糖，其水溶液帶強負電荷，于瓊脂凝膠板上，在電場作用下，向正極方向移動，與肝素國家標準品對照，其移動位置應相一致。32醫(yī)學課件ppt3、樣品脫鹽后等電點聚焦法測定測定藥物的等電點（為出現(xiàn)多條區(qū)帶多個等電點），同批次同一產(chǎn)品的等電點應相同，表明其工藝穩(wěn)定。33醫(yī)學課件ppt（三）生物鑒別法利用生物體進行試驗來鑒別藥物。34醫(yī)學課件ppt二、雜質(zhì)檢查（一）一般雜質(zhì)檢查檢查項目包括氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度或溶液的顏色、水分及干燥失重、熾灼殘渣等。35醫(yī)學課件ppt（二）特殊雜質(zhì)檢查許多藥物是從生物組織中提取或用微生物發(fā)酵法制得，藥物中易殘存一些雜質(zhì)或其他成分。1、原料藥的純度分析2、生產(chǎn)過程中雜質(zhì)檢查36醫(yī)學課件ppt三、安全性檢查（一）熱原檢查法（家兔、鱟試劑）（二）異常毒性試驗：用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其急性毒性反應。反應的判斷以試驗動物死亡與否為終點。37醫(yī)學課件ppt（三）過敏試驗（檢查異性蛋白）藥物中若夾雜有異性蛋白，在臨床使用時易引起病人多種過敏反應，輕者皮膚出現(xiàn)紅斑或丘疹，嚴重者可出現(xiàn)窒息、發(fā)紺、血管神經(jīng)性水腫、血壓下降，甚至休克和死亡。38醫(yī)學課件ppt（四）降壓物質(zhì)檢查法降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導致血壓降低的物質(zhì)。來源：用動物臟器或組織為原料制備生化藥物，正常組織內(nèi)存在的組胺及部分氨基酸脫羧形成的組胺、酪胺等物質(zhì)。39醫(yī)學課件ppt（五）無菌檢查法（檢查活菌）由于許多藥物是在無菌條件下制備的，且不能高溫滅菌。因此，無菌檢查就更有必要。中國藥典中幾乎所有的注射用藥如注射用尿激酶等，均做無菌檢查。40醫(yī)學課件ppt1、無菌檢查的基本步驟：①培養(yǎng)基的制備，為細菌生長、繁殖提供所必需的營養(yǎng)物質(zhì)─碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)等。②選擇對照用菌液，供對照試驗用。③具體檢查，如接種、培養(yǎng)等操作。④結果判斷，得出陰性或陽性的結論。41醫(yī)學課件ppt2、注意事項：①無菌檢查的全部過程應嚴格遵守無菌操作法，包括對操作環(huán)境、試驗材料及用具酶滅菌等，防止微生物污染。②應避免在有抑菌條件下操作。③從事無菌操作人員應具備微生物學的基礎知識及一定工作經(jīng)驗，否則要經(jīng)過無菌技能的培訓，方能從事此工作。42醫(yī)學課件ppt（六）基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物檢查可能雜質(zhì)：殘留DNA、宿主細胞蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素等；主要污染物：微生物、熱原、病毒等。主要檢查項目：外源性DNA、其他外源性雜質(zhì)測定43醫(yī)學課件ppt（七）致突變試驗包括：微生物回復突變試驗、哺乳動物培養(yǎng)細胞染色體畸變試驗、嚙齒動物微核試驗等。（八）生殖毒性試驗包括：一般生殖毒性試驗、圍生期毒性試驗。44醫(yī)學課件ppt四、含量（效價）測定含量表示方法百分含量，適用于結構明確的小分子藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。生物效價或酶活力，適用于酶類、蛋白質(zhì)類等藥物。45醫(yī)學課件ppt（一）含量測定1、HPLC法2、SDS法（二）效價測定：采用國際或國家參考品，或經(jīng)國家檢定機構認可的參考品，以體內(nèi)或體外法測定其生物學活性，并標明其活性單位。46醫(yī)學課件ppt第三節(jié)常用定量分析方法及其應用一、理化法（一）化學分析法1、重量法：根據(jù)樣品中分離出的單質(zhì)或化合物的重量測定所含成分的含量。（1）提取法（2）揮發(fā)法（3）沉淀法47醫(yī)學課件ppt（二）電化學分析法離子選擇性電極：測量離子活度的指示電極。

2、滴定分析法：根據(jù)樣品中某些成分與標準溶液能定量地發(fā)生酸堿中和、氧化還原或絡合反應等進行測定。48醫(yī)學課件ppt（三）光譜分析法1、比色法：樣品與顯色劑可發(fā)生顏色反應，依顏色反應的強度測定含量。如蛋白質(zhì)的含量測定，可利用蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應，而進行定量測定。49醫(yī)學課件ppt2、UV法：樣品或轉化后的產(chǎn)物在某一波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與吸收度成正比，則可進行定量測定。如蛋白質(zhì)在280nm左右有最大吸收

。3、熒光分光光度法：根據(jù)物質(zhì)被UV光照射后產(chǎn)生的熒光強度進行定量測定。50醫(yī)學課件ppt（四）色譜分析法1、HPLC法（1）RP-HPLC法：適用于肽類、氨基酸、蛋白質(zhì)和多糖的測定。固定相：C8、C18烷基硅烷鍵合相流動相：甲醇-水、乙腈-水（甲醇）、乙腈-緩沖液51醫(yī)學課件ppt（2）高效離子交換色譜法（HPIEC）HPIEC特點如下：①蛋白質(zhì)、多肽的分離是根據(jù)其相應的離子化程度而進行的。②分離過程是以鹽濃度增大的梯度洗脫法進行的③柱效中等并具較高質(zhì)量的活性回收。52醫(yī)學課件ppt（3）高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）HPGFC特點如下：①活性蛋白質(zhì)可得以回收。②分離是在固定比例的水溶液中進行的。③分離是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中相應的有效粒徑而進行的。53醫(yī)學課件ppt2、高效毛細管電泳法（HPCE）HPCE是根據(jù)帶電組分在管中由于其所帶電荷和分子量的大小，即核質(zhì)比不同產(chǎn)生不同的遷移速度而分離。54醫(yī)學課件ppt類型酶活力測定法：以酶為分析對象，測定樣品中某種酶的活力或活性，并用活力單位和比活性表示

。酶分析法：以酶為分析工具或分析試劑，測定樣品中酶以外的其它物質(zhì)的含量。二、酶法55醫(yī)學課件ppt（一）酶活力測定法1、定義：酶活力是指酶催化一定化學反應的能力。酶活力的測定實際上是測定一個被酶所催化的化學反應的速度─可以用單位時間反應底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。56醫(yī)學課件ppt2、方法（1）終點法：在適當?shù)臈l件下，把酶和底物混合，測定生成一定量產(chǎn)物所需的時間。（2）將酶和底物混合后隔一定時間，間斷地或連續(xù)地測定反應的連續(xù)變化。57醫(yī)學課件ppt（3）將酶與底物混合后，讓其反應一定時間，然后停止反應，定量測定底物減少或產(chǎn)物生成的量。58醫(yī)學課件ppt（二）酶分析法1、動力學分析法：

通過條件控制，分別使底物、輔酶活化劑或抑制劑的濃度在酶反應中起決定反應速度的主導作用。則酶的反應速度和上述相應因素的濃度間將具有確定的比例關系，通過測定酶反應速度即可求出它們的濃度。59醫(yī)學課件ppt2、總變量分析法（平衡法或終點法）：

根據(jù)被測物質(zhì)（底物）的性質(zhì)，選擇適宜的分析工具酶對該物質(zhì)進行作用，在反應完成后，借助理化方法測出其總變化量，并參考反應的平衡點，計算出被測物的實際含量或濃度。60醫(yī)學課件ppt三、電泳法（一）基本原理電泳法是指帶電微粒如蛋白質(zhì)、核苷酸、其他微粒分子或離子在電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度泳動而使組分分離，再進行檢測