體細(xì)胞胚胎發(fā)生

關(guān)于體細(xì)胞胚胎發(fā)生第1頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖4－1胚狀體第2頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1.2體細(xì)胞胚胎發(fā)生

（somaticembryogenesis）由單細(xì)胞（體細(xì)胞）或一群細(xì)胞被誘導(dǎo)不斷再生非合子胚，并萌發(fā)形成完整植株的發(fā)育過(guò)程稱為體細(xì)胞胚胎發(fā)生。發(fā)生過(guò)程見圖4－2（p61)。第3頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖4－2體細(xì)胞胚胎發(fā)生的各個(gè)時(shí)期單個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)反復(fù)的細(xì)胞分裂形成一個(gè)小細(xì)胞團(tuán)，它經(jīng)歷球形期、心形期和魚雷形期的發(fā)育過(guò)程之后，最終由體細(xì)胞胚長(zhǎng)成一個(gè)小植株。（Dodds和Roberts，1995）第4頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Kohlenbach關(guān)于胚的分類:(1)合子胚：由受精卵或合子形成的胚。(2)非合子胚：由合子之外的細(xì)胞形成的胚。體細(xì)胞胚—由孢子體細(xì)胞（除合子外）離體培養(yǎng)形成的胚。非體細(xì)胞胚—即指芽、短枝、愈傷組織、花粉胚、塊莖、球莖等繁殖體。孤雌生殖胚—由未受精卵形成的胚。孤雄生殖胚—由雄配子體（小孢子花粉粒）形成的胚。第5頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.

體細(xì)胞胚胎發(fā)生的途徑直接途徑：指從培養(yǎng)中的器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體某些部位的胚性細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化出體細(xì)胞胚胎，中間不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段(圖4－3A，圖4－3B)。這種“胚性細(xì)胞”是在胚胎發(fā)生之前就已“決定”了的。間接途徑：指外植體先脫分化形成愈傷組織，再?gòu)挠鷤M織的某些細(xì)胞，即重新“決定”為胚性細(xì)胞的細(xì)胞分化出體細(xì)胞胚胎(圖4－3C)。第6頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖4－3植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式示意圖A．由外植體外層細(xì)胞直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚；B．由外植體組織內(nèi)的細(xì)胞產(chǎn)生體細(xì)胞胚；C．愈傷組織表層細(xì)胞分化為體細(xì)胞胚(引自王亞馥等，2000)第7頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二多數(shù)體細(xì)胞胚胎的形成是通過(guò)間接途徑產(chǎn)生的。它通常分兩個(gè)階段完成：①胚胎發(fā)生叢（embryogenicclump，EC）的形成。②胚狀體的發(fā)育。EC在轉(zhuǎn)入降低或去除生長(zhǎng)素、降低還原氮的培養(yǎng)基后，才能完成胚狀體發(fā)育。第8頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二關(guān)于體細(xì)胞胚胎的起源：體細(xì)胞胚胎究竟起源于單細(xì)胞還是多細(xì)胞，目前仍然有爭(zhēng)論。但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)體細(xì)胞胚起源于單細(xì)胞（例子？）。但也有人認(rèn)為它們起源于一個(gè)以上的細(xì)胞（證據(jù)？）體細(xì)胞胚發(fā)生的實(shí)質(zhì)是細(xì)胞分化，即細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)部分基因開放，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的表達(dá)。第9頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3.影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的因子對(duì)于體細(xì)胞胚胎發(fā)生特別重要的是培養(yǎng)基中的兩種成分，即生長(zhǎng)素和氮源。第10頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

3.1生長(zhǎng)素例子1：胡蘿卜體細(xì)胞胚的發(fā)育（p65～66）

結(jié)論：在增殖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素的存在，對(duì)于胚性細(xì)胞團(tuán)后來(lái)在成胚培養(yǎng)基上發(fā)育為胚是必不可少的。因此，可把增殖培養(yǎng)基看成是體細(xì)胞胚胎發(fā)生的“誘導(dǎo)培養(yǎng)基”。

第11頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二例子2：咖啡體細(xì)胞胚的發(fā)育（p66）

例子3：對(duì)甜橙馴化愈傷組織的詳細(xì)研究，也證實(shí)了生長(zhǎng)素對(duì)胚胎發(fā)生的重要作用（p66～67）

。最終結(jié)論：對(duì)于離體條件下體細(xì)胞胚胎發(fā)生來(lái)說(shuō)，一個(gè)最低限度的內(nèi)源或外源生長(zhǎng)素是必不可少的。

第12頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的步驟：第一步，在生長(zhǎng)素濃度高(2,4-D0.5～1mg／L)的培養(yǎng)基（增殖培養(yǎng)基）上誘導(dǎo)和增殖愈傷組織，高濃度生長(zhǎng)素誘導(dǎo)愈傷組織局部細(xì)胞形成的分生組織細(xì)胞，稱為胚性細(xì)胞團(tuán)(EC)。第二步，將EC轉(zhuǎn)移到極低水平生長(zhǎng)素(0.01～0.1mg／L)或完全無(wú)生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基（胚發(fā)育培養(yǎng)基）上，EC發(fā)育為成熟胚胎。第13頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二其它激素的作用：細(xì)胞分裂素：BAP可促進(jìn)胡蘿卜愈傷組織的細(xì)胞分裂，但抑制它的成胚潛力；ZT促進(jìn)；咖啡葉片愈傷組織要求激動(dòng)素與生長(zhǎng)素比例高。赤霉素：能抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生第14頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3.2氮源除生長(zhǎng)素外，培養(yǎng)基中氮源的形態(tài)也會(huì)顯著影響離體條件下的胚胎發(fā)生。體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和成熟需要大量氮素，通常為還原態(tài)氮如銨鹽。例子1：野生胡蘿卜體細(xì)胞胚誘導(dǎo)例子2：栽培胡蘿卜體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還原態(tài)氮和硝酸鹽(NH4Cl＋NO3－)組合似乎更有利于許多培養(yǎng)體系的體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)。第15頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二欲使胡蘿卜培養(yǎng)細(xì)胞形成體細(xì)胞胚，必須有一個(gè)最低數(shù)量的內(nèi)源NH4＋存在(每千克鮮重的組織約5mmol)。如果內(nèi)源NH4＋達(dá)不到這個(gè)臨界值，細(xì)胞就不能進(jìn)行胚胎分化。而要使細(xì)胞內(nèi)NH4＋達(dá)到這個(gè)水平，不但需要有很少量的外源NH4＋存在(2.5mmol／L)，還需要供應(yīng)相對(duì)濃度很高的NO3－(60mmol／L)。雖然對(duì)于胚胎發(fā)生來(lái)說(shuō)，其他形式的還原態(tài)氮都不如NH4＋有效，但水解酪蛋白、谷氨酰胺和丙氨酸等也可用做可靠的代替品。第16頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3.3其他因子鉀的濃度：在野生胡蘿卜中，高濃度的鉀（20mmol／L）是胚胎發(fā)生所必需的。

溶解氧的含量：培養(yǎng)基中溶解氧的含量應(yīng)低于一個(gè)臨界值（1.5mg／L）。活性炭：培養(yǎng)基中加入活性炭也能提高胡蘿卜細(xì)胞胚胎發(fā)生的頻率。某些揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質(zhì)：抑制愈傷組織中的體細(xì)胞胚胎發(fā)生。

第17頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4.體細(xì)胞胚胎發(fā)生的解剖學(xué)和細(xì)胞學(xué)在胡蘿卜懸浮培養(yǎng)中，對(duì)愈傷組織形成和生長(zhǎng)的解剖學(xué)和組織學(xué)的研究表明，在培養(yǎng)中存在著兩種類型的細(xì)胞：①自由分散在培養(yǎng)基中的大而高度液泡化的細(xì)胞，一般不具胚胎發(fā)生潛力。②成簇成團(tuán)存在的體積小而細(xì)胞質(zhì)致密的細(xì)胞，具成胚潛力。第18頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二5.體細(xì)胞胚成熟和植株發(fā)育用脫落酸處理，體細(xì)胞胚可以發(fā)育成熟。高水平生長(zhǎng)素能抑制莖尖分生組織發(fā)育，當(dāng)胚性細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)入缺乏生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基時(shí)，胚胎常能發(fā)育成熟。與ABA結(jié)合，加入低水平的細(xì)胞分裂素（玉米素0.1μmol／L）可能有利于低密度細(xì)胞培養(yǎng)的胚胎發(fā)生。第19頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體細(xì)胞胚胎發(fā)生可能重復(fù)發(fā)生，從成熟體細(xì)胞胚上又形成一些胚胎發(fā)生的新中心。體細(xì)胞胚的萌發(fā)階段受到體細(xì)胞胚高度不同步發(fā)育的不利影響。各種物理因素也可能影響體細(xì)胞胚成熟，如溫度、蔗糖濃度、光照等。第20頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體細(xì)胞胚在無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)。單胚萌發(fā)的培養(yǎng)基最好添加低水平的玉米素(0.lmmol／L)。小植株形成大量葉片以后，應(yīng)將其移栽到營(yíng)養(yǎng)缽或蛭石中繼續(xù)生長(zhǎng)和發(fā)育。第21頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二6.體細(xì)胞胚與合子胚的比較自學(xué)內(nèi)容（p71~72）第22頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二7.胚性培養(yǎng)物形態(tài)發(fā)生潛能的喪失7.1遺傳假說(shuō)培養(yǎng)細(xì)胞中細(xì)胞核物質(zhì)變化，如多倍性、非整倍性和染色體結(jié)構(gòu)突變，可能與長(zhǎng)期培養(yǎng)物器官發(fā)生或胚胎發(fā)生潛能喪失有關(guān)。這種由遺傳原因造成的形態(tài)發(fā)生潛力的喪失是不可逆的。第23頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二7.2生理假說(shuō)在某些情況下，形態(tài)發(fā)生潛力的下降可能是由于細(xì)胞或組織內(nèi)激素平衡關(guān)系的改變?cè)斐傻?，或是由于?xì)胞對(duì)外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)敏感性的改變?cè)斐傻摹Ｔ谶@種情況下，細(xì)胞雖然停止了器官和胚胎的分化，但不一定就喪失了這種分化能力。因而，在這種情況下，如果改變外部處理?xiàng)l件，有可能夠恢復(fù)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的潛能（器官和胚胎分化）。第24頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二7.3競(jìng)爭(zhēng)假說(shuō)在復(fù)合多細(xì)胞外植體中，只有少數(shù)細(xì)胞能產(chǎn)生胚性細(xì)胞團(tuán)，其余細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞全能性。按照競(jìng)爭(zhēng)假說(shuō)，在有利于非胚性細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下，外植體中的非胚性細(xì)胞大量增殖，結(jié)果在不斷反復(fù)繼代培養(yǎng)的過(guò)程中導(dǎo)致胚性細(xì)胞逐漸消失。到了一定時(shí)期之后，培養(yǎng)物中已不再含有任何胚性細(xì)胞，這時(shí)若想再恢復(fù)它們的胚胎發(fā)生能力就不可能了。第25頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二7.3競(jìng)爭(zhēng)假說(shuō)如果培養(yǎng)物中尚存少量胚性細(xì)胞，它們由于非胚性細(xì)胞的抑制作用，不能表達(dá)自身的細(xì)胞全能性，此時(shí)可以通過(guò)改變培養(yǎng)基成分，選擇性地增殖具有胚發(fā)生全能性的細(xì)胞，有可能恢復(fù)培養(yǎng)物形態(tài)發(fā)生的潛能。第26頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二8.體細(xì)胞胚胎發(fā)生的實(shí)際應(yīng)用8.1無(wú)性繁殖由于胚性細(xì)胞生長(zhǎng)和隨后的體細(xì)胞胚發(fā)育可以在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，所以將體細(xì)胞胚發(fā)生與工程技術(shù)結(jié)合，可以建立大規(guī)模的機(jī)械化或自動(dòng)化培養(yǎng)體系。這種培養(yǎng)體系能循環(huán)生產(chǎn)大量的繁殖體（體細(xì)胞胚胎），且成本低廉。通過(guò)重復(fù)體細(xì)胞胚胎發(fā)生形成體細(xì)胞胚無(wú)性系。第27頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二8.2人工（合成）種子的制備植物人工種子（plantartificialseed）概念最早由Murashige（1978）提出，它是指將植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的體細(xì)胞胚或能發(fā)育成完整植株的分生組織（芽、愈傷組織、胚狀體等）包埋在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和具有保護(hù)功能的外殼內(nèi)形成的在適宜條件下能夠發(fā)芽出苗的顆粒體（圖4－4，圖4－5）。第28頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖4－4人工種子第29頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖4－5人工種子萌發(fā)形成的幼苗第30頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二通過(guò)用人工種皮包被體細(xì)胞胚而制造人工種子（或稱合成種子），用以繁殖遺傳工程植物、減數(shù)分裂不穩(wěn)定的基因型、自交不親合植物、稀有的和珍貴的物種或遠(yuǎn)緣雜交種，以及通過(guò)人工授粉而得到的雜種等是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)之一。第31頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二8.2.1單胚人工種子的制造過(guò)程人工種子由包裹在防護(hù)層中的體細(xì)胞胚組成（圖4－6），在制造單胚人工種子的時(shí)候，主要采用諸如藻酸鈉一類的水凝膠作為體細(xì)胞胚的包被物質(zhì)。當(dāng)體細(xì)胞胚與藻酸鈉混合以后，再滴人到硝酸鈣或氯化鈣溶液（100mmol／L）中，30min內(nèi)表面即可完全絡(luò)合，形成一層持久的種皮（圖4－7，圖4－8）。第32頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖4－6人工種子示意圖（引自Redenbaugh，1990）第33頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖4－7用漏斗分離器生產(chǎn)藻酸鈣包被的人工種子（引自Redenbaugh，1990）第34頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖4－8人工種子的制作第35頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二表4－1可用于包被體細(xì)胞胚的幾種水凝膠水凝膠濃度(％，W／V)絡(luò)合劑濃度(mmol／L)藻酸鈉0.5～5.0鈣鹽30～100藻酸鈉及明膠2.05.0鈣鹽30～100角叉藻聚糖及洋槐豆膠0.2～0.80.4～1.0KCl或NH4CI500表4－1列出了可用做種皮材料的各種水凝膠。第36頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二此外，在種皮基質(zhì)中還可加入一些對(duì)體細(xì)胞胚有益的物質(zhì)，如能促進(jìn)生長(zhǎng)的微生物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、殺蟲劑以及用于旱地播種的親水性化合物等作為人工胚乳。

第37頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二8.2.2工業(yè)化生產(chǎn)人工種子首先，必須建立起適當(dāng)?shù)慕M織培養(yǎng)技術(shù)體系，從中能產(chǎn)生高質(zhì)量的大小一致和發(fā)育期同步的、功能像合子胚一樣的體細(xì)胞胚。

促成體細(xì)胞胚同步發(fā)育的途徑：（p75~76）（1）使用DNA合成抑制劑或低溫培養(yǎng)（2）過(guò)篩（3）利用滲透壓控制胚胎發(fā)育同步性

第38頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二其次，還必須建立大規(guī)模自動(dòng)化的液體培養(yǎng)體系，以便生產(chǎn)數(shù)量足夠的體細(xì)胞胚。此外，生產(chǎn)具有適當(dāng)水分含量的種皮的方法，摻入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和其他附加物質(zhì)的方法，以及用于包埋體細(xì)胞胚的設(shè)備等，也都有待改進(jìn)。第39頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期二8.3分離可再生的原生質(zhì)體的材料胚性愈傷組織、懸浮培養(yǎng)物和體細(xì)胞胚已作為許多植物原生質(zhì)體分離的材料。這些培養(yǎng)體系中的細(xì)胞或組織在培養(yǎng)過(guò)程中表