分子熒光分析

關(guān)于分子熒光分析第1頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三概述分子熒光發(fā)光的機(jī)理影響熒光發(fā)光的因素定量分析方法分子熒光分析法在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用第2頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三概述第3頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三

發(fā)光分析是受激物質(zhì)分子或原子以發(fā)射輻射的形式釋放能量，測量的是物質(zhì)分子或原子自身發(fā)射輻射的強(qiáng)度，屬于發(fā)射光譜法。發(fā)光分析法包括熒光分析法，磷光分析，原子熒光分光光度法和化學(xué)發(fā)光分析。分子吸收了光能而被激發(fā)到較高能態(tài)，在返回基態(tài)時，發(fā)射出與吸收光波長相等或不等的輻射，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光，分子熒光分析是基于這類光致發(fā)光現(xiàn)象而建立起來的分析方法。

第4頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三分子熒光分析物質(zhì)的基態(tài)分子受一激發(fā)光源的照射，被激發(fā)至激發(fā)態(tài)后，在返回基態(tài)時發(fā)射出波長與入射光相同或較長的光，稱為熒光。一種物質(zhì)分子能否發(fā)射出熒光取決于它本身的分子結(jié)構(gòu)和它所在的環(huán)境條件。通常所指的熒光是指紫外-可見光熒光，即利用某些物質(zhì)受到紫外-可見光照射后，發(fā)射出比吸收的紫外-可見光波長更長或相等的紫外-可見光熒光。通過測定物質(zhì)分子產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法稱為分子熒光分析。

熒光分析可應(yīng)用于物質(zhì)的定性及定量，由于物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，所能吸收的紫外-可見光波長不同，所發(fā)射的熒光波長也不同，利用這個性質(zhì)可鑒別物質(zhì)。對于同一物質(zhì)的稀溶液，其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系，利用這個性質(zhì)可以進(jìn)行定量測定。主要特點：1.靈敏度高：檢出限為10-4~10-6g/L。較紫外-可見分光光度法高1~3個數(shù)量級。2.選擇性強(qiáng)：能吸收光的物質(zhì)并不一定能產(chǎn)生熒光，且不同物質(zhì)由于結(jié)構(gòu)不同，雖吸收同一波長的光，但產(chǎn)生的熒光波長也不盡相同。3.用樣量少、操作簡便

。

缺點:

許多物質(zhì)本身不會發(fā)射熒光

應(yīng)用不夠廣泛

第5頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三分子熒光發(fā)光的機(jī)理第6頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三分子的去活化過程：第7頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三當(dāng)處于基態(tài)單重態(tài)（S0）的分子吸收波長為λ1和λ2的輻射后,分別被激發(fā)到第一激發(fā)單重態(tài)（S1*）和第二激發(fā)單重態(tài)(S2*)的任意振動能級上,而后發(fā)生以下過程：

振動弛豫:

在溶液中，受激的溶質(zhì)分子與溶劑分子碰撞，而失去過剩的能量，以10-13~10-11s的極快速度，降至同一電子態(tài)的最低能級上，這一過程屬于無輻射躍遷。內(nèi)轉(zhuǎn)換:當(dāng)兩個電子能級非?？拷灾缕湔駝幽芗売兄丿B時，如第一激發(fā)單重態(tài)的較高振動能級與第二激發(fā)單重態(tài)的某一較低振動能級的位能相同，可發(fā)生電子由高電子能級以無輻射躍遷的方式躍遷至低能級上。此過程效率高，速度快，一般只需10-13~10-11s。

熒光發(fā)射:

處于激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級的分子，也存在幾種可能的去活化過程。若以10-9~10-7s左右的時間發(fā)射光量子回到基態(tài)的各振動能級，這一過程就有熒光發(fā)生。第8頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三激發(fā)光譜和熒光光譜:

任何熒光物質(zhì)都具有兩個特征光譜，即激發(fā)光譜和熒光光譜。激發(fā)光譜:如果將激發(fā)光的光源用單色器分光，測定不同波長激發(fā)光照射下熒光強(qiáng)度的變化，以激發(fā)波長（λ）為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度（IF）為縱坐標(biāo)作圖，便可得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。熒光光譜:固定激發(fā)光波長和強(qiáng)度，而讓物質(zhì)發(fā)出的熒光通過單色器測定不同波長的熒光強(qiáng)度。以熒光的波長（λ）為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度（IF）為縱坐標(biāo)作圖，便得熒光光譜。硫酸奎寧的激發(fā)光譜和熒光光譜

蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜

熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長和最大熒光波長是鑒定物質(zhì)的根據(jù)，也是定量測定時最靈敏的條件。

第9頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三影響熒光發(fā)光的因素第10頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三分子結(jié)構(gòu)影響熒光發(fā)光分子產(chǎn)生熒光的條件：①物質(zhì)必須具有能吸收一定頻率紫外光的特定結(jié)構(gòu)；②物質(zhì)分子在吸收了一定頻率的紫外能之后，必須具有較高的熒光效率，用φF表示:

φF=發(fā)出熒光的量子數(shù)/吸收激發(fā)光的量子數(shù)熒光效率越高，熒光的發(fā)射強(qiáng)度越大，無輻射躍遷的幾率就越小。當(dāng)熒光效率等于零時就意味著不能發(fā)出熒光。因此熒光物質(zhì)必須具有較大的熒光效率。

第11頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三1具有共軛雙鍵體系的分子：大多數(shù)熒光物質(zhì)都具有芳香環(huán)或雜環(huán)，因為這些化合物都具有易發(fā)生π→π*或n→π*躍遷的電子共軛結(jié)構(gòu)，π電子的非定域性越大，就越容易被激發(fā)，分子的熒光效率越大，因此凡能提高π電子共軛程度的結(jié)構(gòu)，如對-苯基化、間-苯基化、乙烯化的作用都會增大熒光的強(qiáng)度。

2苯環(huán)上取代基的類型：給電子基團(tuán)。如-OH、-NH2常使熒光增強(qiáng)。與π電子體系互相作用較小的取代基。如-SO3H對分子熒光影響不明顯。吸電子基團(tuán)如-COOH、-CO減弱甚至破壞熒光。

第12頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三3具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子：剛性的不飽和的平面結(jié)構(gòu)具有較高的熒光效率，分子剛性及共平面性越大，熒光效率越高，酚酞和熒光素比較，熒光素中多一個氧橋，使分子的三個環(huán)成一個平面，其共平面性增加，使π電子的共軛度增加，因而熒光素有強(qiáng)烈熒光，而酚酞的熒光很弱。

酚酞

熒光素第13頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三環(huán)境對熒光的影響：溫度的影響：溫度改變并不影響輻射過程，但非輻射去活的效率將隨溫度升高而增強(qiáng)，因此當(dāng)溫度升高時熒光強(qiáng)度通常會下降。溶劑的影響：隨溶劑極性的增加，熒光物質(zhì)的π→π*躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度將增加。溶劑粘度減小，可以增加分子間碰撞機(jī)會，使無輻射躍遷幾率增加而使熒光強(qiáng)度減弱。若溶劑和熒光物質(zhì)形成氫鍵或溶劑使熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)改變，則熒光波長與熒光強(qiáng)度也會發(fā)生改變。

第14頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三

溶液pH的影響：當(dāng)熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時，溶液的pH對熒光強(qiáng)度有較大影響。因為弱酸或弱堿在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會發(fā)生改變，而熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度會因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。以苯胺為例：在pH7~12的溶液中會產(chǎn)生藍(lán)色熒光，在pH<2或pH>13的溶液中都不產(chǎn)生熒光。pH<2無熒光7~12藍(lán)色熒光>13無熒光

第15頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三定量分析方法1.校準(zhǔn)曲線法：2.標(biāo)準(zhǔn)對照法:3．多組分混合物的熒光分析:校準(zhǔn)曲線法：以已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按試樣相同方法處理后，配成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在儀器調(diào)零后再以濃度最大的標(biāo)準(zhǔn)溶液作基準(zhǔn)，調(diào)節(jié)熒光強(qiáng)度讀數(shù)為100；然后測出其他標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對熒光強(qiáng)度和空白溶液的相對熒光強(qiáng)度；扣除空白值后，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后將處理后的試樣配成一定濃度的溶液，在同一條件下測定其相對熒光強(qiáng)度，扣除空白值后，從校準(zhǔn)曲線上求出其含量。第16頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三分子熒光分析法在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用尿液中的色胺的測定尿中色胺的含量是色氨酸代謝的一個標(biāo)志。色胺有天然熒光，激發(fā)峰285nm，熒光峰360nm。把尿或組織液的色胺萃取出來，就可直接檢測。在0.1~8μg/15mL范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與色胺濃度呈線性關(guān)系。

第17頁，共20頁，2023年，2月20日，星期三尿液中維生素B2的測定:

維生素B2（核黃素）在430~440nm藍(lán)光照射下會發(fā)出綠色熒光，λem為535nm。它在pH6~7的溶液中熒光強(qiáng)度最大，而在pH11時熒光消失；但在堿性溶液經(jīng)光線照射發(fā)生分解作用或在酸性KMnO4氧化下都會生成熒光強(qiáng)度比維生素B2強(qiáng)得多的黃光素，并可溶于氯仿。利