鹽度對XJ-1菌株生長、BChl和Car合成的調(diào)控作用,微生物論文

鹽度對XJ-1菌株生長、BChl和Car合成的調(diào)控作用,微生物論文不產(chǎn)氧光合細(xì)菌(APB)代謝方式靈敏多樣,可營光能自養(yǎng)和異養(yǎng)、化能自養(yǎng)和異養(yǎng)生長,不僅僅是光合作用和生物固氮等機(jī)理研究的模型生物,而且在畜禽、水產(chǎn)和農(nóng)業(yè)種植等領(lǐng)域也顯示出誘人的應(yīng)用前景。APB富含的細(xì)菌葉綠素(BChl)和類胡蘿卜素(Car)是構(gòu)成光合作用光系統(tǒng)的最主要功能成分,在光能的捕獲、傳遞和轉(zhuǎn)化成化學(xué)能的經(jīng)過中具有至關(guān)重要的作用。自從Cohen-Bazire等初次開展光合色素合成調(diào)控研究以來,APB光合色素和色素蛋白復(fù)合體的環(huán)境適應(yīng)性調(diào)控研究一直是國際研究熱門,例如:在Rhodobactersphaeroides、R.capsulatus和Rubrivivaxgelatinosus等菌種中相繼發(fā)現(xiàn)AppA/PpsR、PrrBA、FnrL、RegAB、CrtJ、AerR和FixLJ-K等調(diào)控系統(tǒng)或者信號蛋白,基本說明了光合色素合成的光氧調(diào)控機(jī)制;Mizoguchi和Harada等揭示了BChla合成的最后4步反響,又進(jìn)一步說明紫細(xì)菌中普遍積累這4種BChla相應(yīng)的4種細(xì)菌脫鎂葉綠素(BPhe)a,但由于菌株的差異和環(huán)境因子的不同,光合色素的組成和含量也有較大差異;在Rhodopseudomonaspalustris中,隨光強(qiáng)升高,NBRC100419菌株積累的Lycopene和3,4-Didehydrorhodopin含量升高,Spirilloxanthin含量降低,而在Rits、CGA009、Morita和RhodospirillumrubrumS1等菌株中則表現(xiàn)出相反結(jié)果。由此可見,在不同的菌株中,光和氧對細(xì)胞內(nèi)光合色素的積累呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。除此之外,也有很多關(guān)于營養(yǎng)基質(zhì)以及APB生長抑制劑等對光合色素調(diào)控的報道。鹽度也是重要環(huán)境因子,對微生物的生長具有重要作用,根據(jù)鹽的依靠性和耐受性不同,可分為非嗜鹽、輕度嗜鹽、中度嗜鹽和極端嗜鹽微生物。鹽對APB生長代謝影響的研究已有很多報道,主要集中在菌株耐鹽能力,以及細(xì)胞內(nèi)相容性溶質(zhì)和細(xì)胞膜脂質(zhì)成分等耐鹽機(jī)制等方面,對光合生物光合色素調(diào)控固然也有很多研究,但主要集中在植物、藻類和藍(lán)細(xì)菌,尚未見到鹽對APB光合色素組分和含量影響規(guī)律的系統(tǒng)報道。本課題組從新疆鹽堿土壤中分離到一株能夠耐鹽Rhodobacter.capsulatusXJ-1菌株,在前期光和氧調(diào)控光合色素合成研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了鹽度對XJ-1菌株生長、BChl和Car合成的調(diào)控作用,為進(jìn)一步進(jìn)行鹽度調(diào)控光合基因表示出的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。1、材料和方式方法1.1菌株莢膜紅細(xì)菌。XJ-1由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存,GenBank登錄號為HM370064.1.2培養(yǎng)基采用改進(jìn)的Ormerod培養(yǎng)基,用2.46g/L乙酸鈉取代華而不實(shí)的6.0g/L蘋果酸鈉,以1.0g/L谷氨酸鈉為氮源,pH7.0。1.3NaCl對生長的影響。培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的NaCl。接種量為1%,設(shè)3個重復(fù),置28℃,2500lx光照厭氧培養(yǎng)。不同時間取樣,于UV-2102PCS型紫外可見分光光度計(jì)(MAPADA)測定菌體生物量和活細(xì)胞吸收光譜。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。1.4生物量的測定。采用比濁法,用1cm石英比色杯于UV-2102PCS型紫外可見分光光度計(jì)上測定波長660nm處的光密度(OD660),以O(shè)D660表示菌體生物量。1.5活細(xì)胞吸收光譜測定。離心收集光照厭氧培養(yǎng)物菌體細(xì)胞,于pH7.5,10mmol/LTris-HC1緩沖液洗滌2次,懸浮于質(zhì)量60%蔗糖溶液,用光程為1cm石英比色杯,于UV-2102PCS型紫外可見分光光度計(jì)上進(jìn)行波長掃描。1.6色素含量測定。離心收集光照厭氧液體培養(yǎng)物菌體細(xì)胞,蒸餾水洗滌3次。菌體依次用甲醇、丙酮甲醇(7∶2,V/V)和丙酮各提取1次。離心收集上清,殘存余留物繼續(xù)依次參加提取劑重復(fù)上述處理經(jīng)過,最后合并提取液。Car的定量按Jessen公式進(jìn)行計(jì)算,C=(DVf10)/2500,華而不實(shí)C為Car量(mg),V為提取液總體積(mL),f為稀釋倍數(shù),D為Car最大吸收峰的光密度,2500為Car平均消光系數(shù)。BChl含量參Beer-Lam-bert-Bouguer定律進(jìn)行計(jì)算,C=DVf/(aL)103,華而不實(shí)a為消光系數(shù)(lg-1cm-1),L為光程(cm)。全色素總量是Car總量和BChl總量之和。色素提取在黑暗中進(jìn)行。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。1.7色素組分的TLC分析。色素提取液經(jīng)減壓蒸發(fā)枯燥,用乙醚溶解,在硅膠G板上進(jìn)行點(diǎn)樣,展層劑為石油醚、正己烷、異丙醇、丙酮和甲醇(8∶0.75∶0.2∶0.8∶0.25,V/V),展層結(jié)束后立即拍照,得到色素的TLC指紋圖譜圖像,再用Gel-Proanalyzer軟件進(jìn)行灰度分析。1.8色素組分的鑒定。從TLC層析板上刮取各條帶色素,溶于丙酮中,充分振蕩,離心取上清,用光程為0.2cm石英比色杯,于UV-2102PCS紫外可見分光光度計(jì)上進(jìn)行波長掃描。根據(jù)吸收光譜、極性、球形烯合成途徑和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對色素組分進(jìn)行鑒定。2、結(jié)果和分析2.1NaCl對菌株XJ-1生長的影響如此圖1A所示,隨NaCl濃度增加至0.2mol/L時,菌體的生長速率和最終生物量逐步升高并到達(dá)最大,繼續(xù)增加NaCl濃度,菌體的生長速率和最終生物量則逐步降低。菌株XJ-1生長不需要NaCl即可良好生長,最適NaCl濃度為0.2mol/L,到達(dá)0.4mol/LNaCl時,菌體仍能生長。這表示清楚菌株XJ-1是一株耐鹽菌,與文獻(xiàn)報道的R.capsulatusE1F1菌株的耐鹽特性有差異。2.2NaCl對菌株XJ-1吸收光譜的影響菌株XJ-1在含有NaCl的培養(yǎng)基中光照厭氧生長72h,液體培養(yǎng)物呈黃棕色,其活細(xì)胞吸收光譜如此圖1B所示。培養(yǎng)基中未添加NaCl時,細(xì)胞呈現(xiàn)376nm、590nm、804nm和860nmBChl系BChla特征光譜和447nm、480nm和510nm球形烯系Car特征光譜。當(dāng)培養(yǎng)基中含有0.3mol/LNaCl時,與對照相比,各特征峰未見明顯變化,位移在0~4nm內(nèi),當(dāng)含有0.4mol/LNaCl時,僅顯示微小的802nm和863nm吸收峰,其他色素峰均不明顯。2.3NaCl對菌體色素含量的影響如此圖1C所示,當(dāng)NaCl濃度為0~0.2mol/L時,隨著鹽度增加,菌體積累的BChla和Car含量逐步升高,若繼續(xù)增加NaCl濃度,菌體積累的BChla和Car含量則逐步降低。2.4色素組分的TLC分析菌株XJ-1光合色素的薄層層析(TLC)如此圖2A所示,色素TLC圖譜呈現(xiàn)分辨良好的6條色帶,色帶的顏色分別為綠色(T1)、紫色(T2)、紫色(T3)、黃色(T4)、紅色(T5)和黃色(T6)。在含有0.2和0.4mol/LNaCl培養(yǎng)基中,菌體積累6種主要的色素組分,與未添加NaCl培養(yǎng)物對照相比(CK),鹽濃度下菌體細(xì)胞又新合成了一種紫色條帶(T2)。TLC圖譜各色帶吸收光譜如此圖2B所示,根據(jù)吸收光譜特征吸收峰數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù),T1鑒定為BChla衍生物,T2和T3為細(xì)菌脫鎂葉綠素(Bphe),但T2特征吸收峰為356nm、384nm、526nm、681nm和738nm,與文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)有所差異;T4和T6分別為羥基球形烯(OH-SE)和球形烯(SE),T5為球形烯酮(SO)。利用Gel-Proanalyzer軟件將TLC圖譜轉(zhuǎn)化為色素的灰度(Intensity)對Rf的曲線,如此圖2C所示。用各色素條帶的灰度的相對面積表示其相對含量,如此圖2D所示。未添加NaCl時,菌體細(xì)胞主要積累5種色素組分,分別為BChla、Bphe、OH-SE、SO和SE,華而不實(shí)Bphe和OH-SE相對含量很低。當(dāng)NaCl濃度為0.2和0.4mol/L時,菌體細(xì)胞額外積累了一種Bphe組分。隨著NaCl濃度升高,菌體積累的BChla和SE的相對含量降低,2種Bphe組分的相對含量則增加,而OH-SE和SO則呈先升后降的趨勢。由此可見,菌株XJ-1光合色素的積累對鹽度變化的響應(yīng)靈敏,隨著鹽度的變化,菌體光合色素的積累量與菌體的生長相關(guān)聯(lián),光合色素的組分和相對含量也隨之發(fā)生了規(guī)律性的變化。3、討論APB類群廣泛分布于自然環(huán)境中,從淡水到飽和鹵水鹽濃度范圍都能發(fā)現(xiàn)它們。已有研究表示清楚,自然生境中的鹽濃度是決定特定APB種類生長繁衍的一個重要的選擇性因子。莢膜紅細(xì)菌廣泛分布于富含有機(jī)物的淡水水體和土壤環(huán)境中,耐鹽能力較低,Ige珘no等較為具體地報道了一株具有耐鹽能力的R.cap-sulatusE1F1菌株,無鹽時生長最好,在0.1~0.3mol/LNaCl范圍內(nèi),隨鹽度增加,生長逐步遭到抑制。本研究的XJ-1菌株最適生長的NaCl濃度為0.2mol/L,與E1F1菌株的耐鹽特性明顯不同。眾所周知,光合色素是光合生物營光合作用生長的核心功能成分,生物體內(nèi)積累的光合色素受環(huán)境因子調(diào)控。APB富含BChl和Car兩大類光合色素,其構(gòu)造明顯不同于植物、藻類和藍(lán)細(xì)菌的光合色素。關(guān)于鹽對光合色素影響的報道主要集中在植物、藻類和藍(lán)細(xì)菌,如在0.05~0.2mol/LNaCl環(huán)境中,隨濃度升高,泡桐無性系葉綠素和類胡蘿卜素含量呈下降趨勢。Singh等研究表示清楚,0.2mol/LNaCl抑制藍(lán)細(xì)菌(Fremyelladiplosiphon)葉綠素的積累。當(dāng)前尚未見到鹽對APB光合色素響應(yīng)研究的系統(tǒng)報道。本研究結(jié)果表示清楚:不同鹽度對XJ-1菌株的生長和光合色素的合成具有明顯的影響,0~0.2mol/LNaCl范圍內(nèi),隨鹽度增加,菌體的生長速率、最終生物量以及積累的BChla和Car含量升高,繼續(xù)增加鹽度,菌體生長速率、最終生物量以及積累的BChla和Car含量又逐步降低。近期研究表示清楚:在紫細(xì)菌中普遍存在4種BChla中間產(chǎn)物BChlaGG、BChlaDHGG、BChlaTHGG和BChlaP,但4種BChla的相對含量因環(huán)境條件和菌株而異;另外,菌體中也積累4種BChla相應(yīng)的BPhea,主要分布于反響中心(RC)復(fù)合體中,其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于相應(yīng)的BChla含量,但BPhe在細(xì)胞內(nèi)的構(gòu)成機(jī)制尚不清楚。本課題組前期研究結(jié)果表示清楚:在光照厭氧和黑暗好氧條件下,該菌株只積累1種BChla和1種Bphe,而在光照好氧條件下,能夠積累1種BChla和2種Bphe。而本研究表示清楚:在無添加NaCl的光照條件下,菌體只積累1種BChla和1種Bphe,隨著NaCl升高,BChla相對含量逐步降低,又積累了另外1種Bphe,這2種Bphe相對含量逐步增加,與光照好氧條件下積累兩種Bphe的現(xiàn)象一致。由于紫細(xì)菌中積累的4種BChla或4種Bphe的吸收光譜基本一