地中海貧血基因檢測(cè)的臨床應(yīng)用

關(guān)于地中海貧血基因檢測(cè)的臨床應(yīng)用第1頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2一、地中海貧血第2頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3

全球有3.5億人為地中海貧血基因攜帶者（占總?cè)丝诘?%）中國(guó)南方高發(fā)地區(qū)人群攜帶率最高可達(dá)到24%地中海貧血的地域分布α-地貧分布β-地貧分布第3頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三中國(guó)南方地貧基因攜帶率

地區(qū)攜帶率(%)

地貧β地貧合計(jì)廣東

8.532.5411.07廣西

14.956.7821.73四川

1.922.184.1臺(tái)灣

4.201.105.3香港

5.023.418.43Xu,etal.JClinPathol2004,57:517-22.

Cai,etal.ChiJEpidemiol2002,23:281-5.

在我國(guó)，地中海貧血主要在南方廣東、廣西、海南、四川、重慶等省市發(fā)病率較高，以廣西、廣東最為嚴(yán)重。4第4頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三遺傳性血紅蛋白病三大類?地中海貧血(地貧)（Thalassemias

）常見(jiàn)為-地貧

和-地貧?異常血紅蛋白病珠蛋白結(jié)構(gòu)異常，絕大部分沒(méi)有或有輕度臨床診斷?遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白珠蛋白的合成不隨著胎兒的發(fā)育而發(fā)生改變，胎兒血紅蛋白持續(xù)表達(dá)。第5頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三地中海貧血定義及分類地中海貧血（Thalassemia）簡(jiǎn)稱地貧（Thal），是由于血紅蛋白的珠蛋白肽鏈基因突變或缺失，使某種珠蛋白肽鏈合成障礙而致的一種遺傳性慢性溶血性貧血。血紅蛋白分子是由珠蛋白+血紅素組成，珠蛋白由兩對(duì)（4條）肽鏈構(gòu)成。第6頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三根據(jù)珠蛋白肽鏈基因（簡(jiǎn)稱α基因或β基因）缺失、缺陷或基因突變和珠蛋白肽鏈合成障礙的不同，可將地貧分為α型、β型、δβ型和δ型四種，其中以α型和β型地貧較為常見(jiàn)。地中海貧血定義及分類第7頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三人類血紅蛋白的合成和演變胚胎期胎兒期成人gower1-ζ2ε2gower2-α2ε2

Portland-ζ2γ2HbF-α2γ2HbA-α2β2HbA-α2β2HbA2-α2δ2HbF-α2γ2第8頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三地貧血紅蛋白的組成正常成人血紅蛋白（Hb）有三種：HbA(α2β2)(

2.5—3.5%)、HbA2(α2δ2)(96.5-97.5%)、HbF(α2γ2)(0-1.0%)。第9頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三α地中海貧血及基因型a2a1a2a1a2a2a1a2a1a2a1a2a1a2a1a2a1血紅蛋白正常輕型：2個(gè)α基因缺失或突變中間型（HbH疾?。?個(gè)α基因缺失或突變HbBart‘s：3個(gè)α基因缺失或突變靜止型：1個(gè)α缺失或突變第10頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三α地中海貧血的臨床特征臨床特點(diǎn)靜止型（α地貧2）輕型或標(biāo)準(zhǔn)型（α地貧1）中間型（HbH病/CS型HbH病）重型HbBart’s胎兒水腫綜合征）發(fā)病年齡＜3個(gè)月兒童，成人兒童，成人胎兒貧血程度無(wú)無(wú)或輕度中度～重度重度黃疸無(wú)無(wú)輕度～中度無(wú)或輕度肝脾腫大無(wú)無(wú)或輕度輕度～中度重度血片RBC：形態(tài)異常正常輕度中度～重度重度血紅蛋白電泳正常正常HbH帶或伴HbBart’sHbConstantSpring大量HbBart’s伴HbPortland少量HbHHbF正常正常正?；蜉p度減少無(wú)HbH包涵體無(wú)無(wú)或可有強(qiáng)陽(yáng)性陽(yáng)性α/β1∶10.7～0.950.3～0.6基因診斷缺失1個(gè)或突變?chǔ)力?α-，ααT/αα缺失2個(gè)或突變?chǔ)力?--或αα/αT-缺失3個(gè)或突變?chǔ)?/--，ααT/--缺失4個(gè)--/--第11頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三α-地貧血紅蛋白比較表型HbAHbBart’sHbH正常人97-98%00靜止型攜帶者96-98%0-2%(Atbirth)0輕型地貧癥狀85-95%2-8%(Atbirth)<2%HbH疾病下降<10%(Atbirth)5-40%HbBart‘s070-80%(with20%HbPortland)0-20%第12頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三β地中海貧血及基因型βGeneβGeneβGeneβGeneβGeneβGene純合子:兩個(gè)基因正常雜合子:一個(gè)正常，另一個(gè)不正常純合子:兩個(gè)基因都不正常XXX第13頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三β地中海貧血的基因型和臨床類型基因型遺傳型分子遺傳基礎(chǔ)臨床類型臨床特點(diǎn)Hb電泳β0/β0純合子無(wú)β肽鏈合成重型重度貧血HbF99.6%β+/β+純合子有少量β肽鏈合成重型或中間型取決于β基因缺失程度和α基因代償和度HbF、HbA2β0/β+雙重雜合子等位基因均有病變，β肽鏈合成10%重型或中間型一般重于β+/β+純合子HbF、HbA2β0/β雜合子點(diǎn)突變，病變基因不成β肽鏈輕型無(wú)癥狀，偶然發(fā)現(xiàn)HbA2、HbFβ+/β雜合子點(diǎn)突變，仍可做成β肽鏈輕型無(wú)癥狀，偶然發(fā)現(xiàn)HbA2、HbFβ+/βE雙重雜合子β肽鏈合成減少，βE肽鏈合成重型中重度貧血HbE、HbFβ+/βS雙重雜合子β肽鏈合成減少，βS肽鏈合成重型中重度貧血HbE、HbF第14頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三表現(xiàn)型HbAHbA2HbF正常正常正常正常靜止型攜帶者正常正常正常βTHAL輕型降低正常或增加正常或增加βTHAL中間型降低正?；蛟黾釉黾应耇HAL重型降低通常增加增加β地中海貧血血紅蛋白組成第15頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三16地貧的危害輕度地貧患者無(wú)特別不良反應(yīng)中、重度地貧患者有貧血癥狀，如渾身無(wú)力、

肝脾腫大等，隨著年齡增長(zhǎng)會(huì)越來(lái)越嚴(yán)重。重型α地貧患兒在出生24－48小時(shí)之內(nèi)死亡，而且產(chǎn)婦因胎兒水腫、大胎盤，極易導(dǎo)致死產(chǎn)。

重型β地貧以及部分中間型α地貧患者在出生后半年左右出現(xiàn)進(jìn)行性貧血，只能靠輸血維持生命，多在童年夭折。第16頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三17地貧患者的困境4000元：重型地貧患兒平均每月需4000元的治療費(fèi)用以維持生命。成年人每月的治療費(fèi)用接近萬(wàn)元，每年治療費(fèi)用至少10萬(wàn)元，每例重癥地貧患兒出生給社會(huì)和家庭帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)高達(dá)100-300萬(wàn)元。20歲：重型β地貧患兒需要終生輸血治療，平均存活年齡僅10歲左右，得不有效治療的重型地貧患兒很難活到20歲。造血干細(xì)胞：根治重型地貧患兒的唯一方法移植造血干細(xì)胞。費(fèi)用超過(guò)40萬(wàn)，且有90%的患者配對(duì)不成功。第17頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三18地貧預(yù)防手段地貧的病因決定了它難治卻可防18第18頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三19社會(huì)關(guān)注-世界地貧日2013年5月8日第20個(gè)“世界地貧日”中國(guó)宣傳主題：地貧防控從婚前孕前開(kāi)始第19頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三20地貧遺傳模式若夫婦二人是同一種地貧基因的攜帶者，那么他們每次懷孕都有1/4的概率懷有重度地貧患兒的可能。若夫婦二人確診一方為地貧基因的攜帶者，而另一方完全正常，則每次懷孕，孩子有1/2幾率是地貧基因攜帶者1/2完全正常。第20頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三21篩查對(duì)象地中海貧血患者-病因診斷孕前夫妻雙方-明確生育地中海貧血兒風(fēng)險(xiǎn)高危人群-已經(jīng)生育地中海貧血兒的夫妻雙方新生兒篩查-盡早診斷、盡早治療孕期夫妻雙方-防止生育地中海貧血兒第21頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三22正常人群也需要進(jìn)行地貧基因檢測(cè)！

全民注重優(yōu)生優(yōu)育；

人口流動(dòng)性大，地貧患者分散性高；

正常人群中地貧基因攜帶者約占2%；第22頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三23病因探究找到方法地中海貧血α點(diǎn)突變/缺失β地中海貧血基因輕型β－地中海貧血、中間型β－地中海貧血、重型－β海貧血遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)癥α地中海貧血基因靜止型、標(biāo)準(zhǔn)型、HbH病、Bart’s胎兒水腫綜合征β點(diǎn)突變第23頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三地貧產(chǎn)品介紹第24頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三25通量高—每次檢測(cè)可分析96個(gè)樣本品質(zhì)優(yōu)—陰、陽(yáng)性符合率均為100%時(shí)間短—報(bào)告時(shí)間最短可至5小時(shí)分型強(qiáng)—每個(gè)突變位點(diǎn)準(zhǔn)確分型覆蓋廣—可覆蓋中國(guó)人95%以上突變種類多—外周血、羊水、絨毛、臍帶血、足血片第25頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三26序號(hào)基因縮寫突變位點(diǎn)描述序號(hào)基因縮寫突變位點(diǎn)描述1HBAWS122Codon122(C->G)13HBBCD43CD43G>T2HBAQS125Codon125(T->C)14HBB-29-29A>G3HBACS142Codon142(T->C)15HBBInt起始密碼子ATG>AGG4HBA-SEASEA缺失16HBBCD14-15CD14-15(+G)5HBA-3.73.7缺失17HBBCD27-28CD27-28(+C)6HBA-4.24.2缺失18HBB-32-32C>A7HBBCD41-42CD41-42(-TCTT)19HBB-30-30T>C8HBBIVS-2-654IVS-2-654C>T20HBBIVS-1-1IVS-1-1G>T9HBBCD17CD17A>T21HBBIVS-1-5IVS-1-5G>C10HBB-28-28A>G22HBBCD31CD31(-C)11HBBCD26CD26G>A23HBBCapCAP+40-+43(-AAAC)12HBBCD71-72CD71-72(+A)\\\\本試劑盒適用于人DNA樣本的地中海貧血基因型（包含3種α突變、3種α缺失及17種β突變）中國(guó)常見(jiàn)的突變基因型的檢測(cè)，可用于人地中海貧血的輔助診斷及適用于大樣本量的攜帶者篩查和產(chǎn)前基因診斷。覆蓋廣第26頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三27品質(zhì)優(yōu)點(diǎn)突變與測(cè)序結(jié)果符合率高達(dá)100%三家臨床醫(yī)院廣東省婦幼保健院、廣西省婦幼保健院及湖北省婦幼保健院結(jié)果匯總見(jiàn)下表：陽(yáng)性符合率（臨床靈敏度）=711/（711+0）=100%；陰性符合率（臨床特異性）=709/（0+709）=100%；總符合率=（711+709）/（711+0+0+709）=100%；檢測(cè)方法陽(yáng)性樣品陰性樣品α點(diǎn)突變?chǔ)曼c(diǎn)突變現(xiàn)代高達(dá)試劑盒260478573測(cè)序260478573共計(jì)738573第27頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三檢測(cè)方法陽(yáng)性樣品陰性樣品現(xiàn)代高達(dá)試劑盒428217Gap-PCR428217品質(zhì)優(yōu)缺失突變與Gap-PCR結(jié)果符合率高達(dá)100%陽(yáng)性符合率（臨床靈敏度）=428/（428+0）=100%；陰性符合率（臨床特異性）=217/（0+217）=100%；總符合率=（428+217）/（428+0+0+217）=100%；第28頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三29時(shí)間短檢測(cè)流程樣本核酸提取20min多重PCR擴(kuò)增2.5hr液相雜交15min結(jié)果檢測(cè)與判讀

1min/test第29頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三30分型強(qiáng)全新液相芯片技術(shù)簡(jiǎn)介二維數(shù)字編碼磁珠藻第30頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三分型強(qiáng)全新液相芯片技術(shù)簡(jiǎn)介第31頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

目前，國(guó)內(nèi)地貧分子診斷方法主要有Gap-PCR、反向斑點(diǎn)雜交、導(dǎo)流雜交、測(cè)序等。其中Gap-PCR只能檢測(cè)出α地貧中的缺失型，反向斑點(diǎn)雜交需要兩次檢測(cè)才能完整的檢出α、β-地貧；導(dǎo)流雜交技術(shù)不能做到基因位點(diǎn)的準(zhǔn)確分型；而測(cè)序方法需要昂貴的儀器，復(fù)雜序列分析，人工經(jīng)驗(yàn)要求高，不利于大規(guī)模篩查。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有地中海貧血基因檢測(cè)技術(shù)及現(xiàn)狀第32頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三α-地中海貧血β-地中海貧血亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司α-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(gap-PCR法)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第3401088號(hào)β-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(反向點(diǎn)雜交法)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3400676號(hào)中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司α-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(gap-PCR法)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2011第3401628號(hào)β-地中海貧血基因分型檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第3401665號(hào)珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司東南亞型α-地中海貧血Zeta鏈蛋白檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2011第3400228號(hào)深圳益生堂生物企業(yè)有限公司β地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(PCR探針?lè)?(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第3400354號(hào)廈門致善生物科技有限公司β-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3401294號(hào)潮州凱普生物化學(xué)有限公司α-和β-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(PCR+膜雜交法)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第3400399號(hào)北京現(xiàn)代高達(dá)生物技術(shù)有限責(zé)任公司α-和β-型地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(PCR-雜交法)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3401572號(hào)地中海貧血檢測(cè)試劑盒第33頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三現(xiàn)代高達(dá)同類產(chǎn)品（Gap-PCR、膜雜交）樣本收集樣本收集基因組DNA獲取基因組DNA獲取缺失和突變分2管進(jìn)行PCR擴(kuò)增α缺失，α點(diǎn)突變和β點(diǎn)突變分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增多重微珠雜交（30min）Gap-PCR核酸電泳（1h）膜雜交（2-4h）自動(dòng)化洗滌（5min）人工洗滌（膜雜交）電腦軟件自動(dòng)判讀人工判斷，UV下觀察α缺失突變?nèi)斯づ凶x，2張膜條分別對(duì)α和β進(jìn)行判讀同類產(chǎn)品操作流程對(duì)比第34頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三比較內(nèi)容現(xiàn)代高達(dá)同類產(chǎn)品（Gap-PCR、膜雜交）檢測(cè)位點(diǎn)同時(shí)對(duì)α缺失、α突變及β突變檢測(cè)分別對(duì)α缺失、α突變及β突變檢測(cè)基因分型可以準(zhǔn)確區(qū)分雜合和純合型只能區(qū)分少數(shù)位點(diǎn)結(jié)果分析儀器自動(dòng)分析判斷人工分析判讀，耗時(shí)耗力報(bào)告時(shí)間1天4-7天（96個(gè)樣品）分析通量96樣本/次，適合大樣本量檢測(cè)單個(gè)樣本分析自動(dòng)化程度高，樣本轉(zhuǎn)管無(wú)需再次標(biāo)記，電腦自動(dòng)化判讀結(jié)果等低，樣本標(biāo)記繁多，易出錯(cuò)，結(jié)果檢測(cè)靠手工操作等準(zhǔn)確度高，自動(dòng)化高，減少人工錯(cuò)誤，較高，但穩(wěn)定性差，受經(jīng)驗(yàn)、環(huán)境因素等影響耗材費(fèi)用低低環(huán)境污染無(wú)使用EB，有致癌性（Gap-PCR）自備試劑只需純水，用于顯色液和洗液稀釋需自己配制或購(gòu)買雜交液、電泳液等同類產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)對(duì)比第35頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三通量高—采用自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)，每次可同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣本，分析樣本通量高；品質(zhì)優(yōu)—結(jié)果為數(shù)字信號(hào)，由軟件自動(dòng)判讀，同時(shí)生成檢測(cè)報(bào)告單，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠，有