基因工程和蛋白質(zhì)工程

關(guān)于基因工程和蛋白質(zhì)工程第1頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)生物工程概述一、生物工程概念及研究技術(shù)二、在現(xiàn)代工、農(nóng)、醫(yī)領(lǐng)域中的應(yīng)用第2頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三一、生物工程的概念及研究技術(shù)1.基因工程——在分子水平的遺傳操作技術(shù)2.細胞工程——遺傳物質(zhì)在細胞間的轉(zhuǎn)移4.生化工程——生物工程產(chǎn)品的最終取得手段3.酶工程——酶的改造和設(shè)計第3頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三基因工程是指在微觀領(lǐng)域（分子水平）中，根據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)原理，設(shè)計并實施一項把一個生物體中有用的目的DNA(遺傳信息)轉(zhuǎn)入另一個生物體中，使后者獲得新的需要的遺傳性狀或表達所需要的產(chǎn)物，最終實現(xiàn)該技術(shù)的商業(yè)價值?；蚬こ袒蚬こ膛c建筑工程第4頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三基因工程操作水平：DNA分子水平目的：定向改變遺傳物質(zhì)或獲得基因產(chǎn)物。2、基因工程的理論基礎(chǔ)1）物質(zhì)基礎(chǔ)——脫氧核苷酸2）結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)——規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)3）中心法則，共用一套遺傳密碼第5頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三細胞工程1、細胞工程的概念

利用細胞融合技術(shù)把含有不同遺傳物質(zhì)的細胞合成雜種細胞。并使之分裂生長成為雜種生物。 它包括體細胞融合、核移植、細胞器攝取和染色體片段的重組等。第6頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三細胞工程操作水平：細胞整體水平或細胞器水平目的：定向改變遺傳物質(zhì)或獲得細胞產(chǎn)品。2、細胞工程的理論基礎(chǔ)——細胞全能性依據(jù)——生物體的每一個干細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)。第7頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三異種植物細胞雜種細胞轉(zhuǎn)基因植物異種動物細胞動物細胞群重組細胞體細胞細胞核早期胚胎受精卵去核卵細胞克隆動物試管嬰兒動物細胞融合植物體細胞雜交植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)核移植胚胎移植體外受精第8頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三3、主要技術(shù)植物組織培養(yǎng)植物體細胞雜交動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合單克隆抗體技術(shù)胚胎移植核移植植物細胞工程技術(shù)動物細胞工程技術(shù)第9頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三酶工程 酶工程是利用酶的特異催化功能，在常溫長壓下將一種物質(zhì)轉(zhuǎn)化為另一種物質(zhì)，以獲得高純度的適用之物。 該技術(shù)包括各種酶的開發(fā)和生產(chǎn)。酶的分離和純化技術(shù)等。酶工程用于食品工業(yè)很有效。啤酒、醬油、葡萄糖等都可用酶工程生產(chǎn)。第10頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三二、生物工程在現(xiàn)代工、農(nóng)、醫(yī)領(lǐng)域中的應(yīng)用1.化工及冶金工業(yè)2.輕工和食品工業(yè)4.農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)3.醫(yī)藥工業(yè)5.環(huán)保和能源工業(yè)第11頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三稀少珍貴的蛋白質(zhì)藥物1982年，美國食品與藥物管理局批準了首例基因工程產(chǎn)品—人胰島素投放市場——它標志了基因工程產(chǎn)品正式進入到商業(yè)化階段。人生長激素、表皮生長因子、腫瘤壞死因子、a-干擾素、纖維素酶、抗血友病因子、紅細胞生成素、尿激酶原、白細胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等第12頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三畜牧業(yè)中的應(yīng)用動物疫苗、生長激素等例：從轉(zhuǎn)基因羊的羊奶中提取出治療心臟病的藥物tPA（組織溶解酶原激活劑）。第13頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三種植業(yè)中的應(yīng)用用攜帶外源基因的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體，使外源DNA與植物染色體DNA整合，通過原生質(zhì)體的培養(yǎng)分化成愈傷組織，最后發(fā)育成具有新性狀的完整植株—轉(zhuǎn)基因植物第14頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三基因工程包括DNA重組技術(shù)和其他使基因結(jié)構(gòu)得以定向改造的技術(shù)。本節(jié)主要介紹DNA重組技術(shù)，大體上包括下列5個步驟?；蚬こ淌?973年由美國斯坦福大學(xué)科恩和舊金山大學(xué)醫(yī)學(xué)院的博耶創(chuàng)立的概念第二節(jié)基因工程第15頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三DNA重組的技術(shù)路線

ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmolecule

Introductionintohostcellsbytransformation

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因的制備

2、載體的構(gòu)建

3、目的基因與載體的重組

4、重組體導(dǎo)入宿主細胞進行擴增

5、克隆基因的鑒定第16頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三一、目的基因的獲得二、基因載體三、重組DNA的篩選及表達第17頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三一、目的基因的獲得1.限制酶——特異性切割DNA的手術(shù)刀2.取得目的基因的方法——分離法及合成法第18頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三1.

限制性內(nèi)切酶

DNA重組即是將兩種DNA分子經(jīng)過切割，選擇適合的片段連接起來的過程實現(xiàn)這一步，是在限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以后才實現(xiàn)的

限制性內(nèi)切酶：一類核酸內(nèi)切酶，可以將外源DNA在特定位點切割降解。以后從細菌中分別分離出了I型和Ⅱ型兩類限制性內(nèi)切酶。

第19頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三限制性內(nèi)切酶的命名

用細菌同名的第一個字母（大寫）和種名的前兩個字母（小寫）構(gòu)成酶的基本名稱。若酶是從其中一種特殊菌株來，還在基本名稱后加上菌株名稱符號。名稱后的羅馬數(shù)字，表示在該特殊菌株中發(fā)現(xiàn)此酶的先后次序。如HaeII是從（Haemophilusaegypticus）中提取的，并且是從中發(fā)現(xiàn)的第二個酶。第20頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三限制性內(nèi)切酶切割DNA的方式

a.從識別序列的中間切開b.在識別序列對稱軸的左右兩方進行切割

c.在識別序列對稱軸的右邊（5’-3’鏈）和對稱軸左邊（3’-5’鏈）切開

第21頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三a.從識別序列的中間切開

從識別序列的中間切開產(chǎn)生平齊末端（bluntends），

如HaeⅢ

第22頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三b.在識別序列對稱軸的左右兩方進行切割

即分別在5’-3’鏈和3’-5’鏈對稱軸的左右方切開，形成帶有凸出的5’磷酸基團的粘性末端（Cohesiveends），如EcoRⅠ第23頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三c.在識別序列對稱軸的右邊（5’-3’鏈）和對稱軸左邊（3’-5’鏈）切開形成帶有凸出的3’羥基的粘性末端，如pstI第24頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三2.取得目的基因的方法

——分離法及合成法（1）DNA片段的直接提?。?）用噬菌體或質(zhì)粒直接從宿主細胞中將目的基因攜出（3）使用相應(yīng)的mRNA分離基因第25頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三二、基因載體1.質(zhì)?！旧w以外的遺傳單元2.噬菌體——感染細菌的病毒第26頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三

質(zhì)粒是一種環(huán)狀雙鏈的DNA分子。自身在細菌細胞中能不斷復(fù)制繁殖。研究比較深入的質(zhì)粒有大腸桿菌的性因子（F因子）、大腸桿菌素因子和抗藥因子等

抗藥因子（質(zhì)粒）在其DNA上編碼有某些酶的基因，表達產(chǎn)生的酶對鏈霉素、氯霉素、磺胺、青霉素、四環(huán)素、卡那霉素等藥物能產(chǎn)生生物化學(xué)修飾，使之鈍化而失效1.質(zhì)?！旧w以外的遺傳單元第27頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三質(zhì)粒的作用質(zhì)粒DNA能從細菌中提出來，又能再轉(zhuǎn)入細菌。這個過程稱轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA仍能進行復(fù)制，這種性能為DNA重組技術(shù)提供了重要的條件，即將一種外源基因與質(zhì)粒重組后，再轉(zhuǎn)入細菌中去復(fù)制繁殖，使外源基因得以增殖。質(zhì)粒自身的某些抗藥基因成為從轉(zhuǎn)化的細菌中篩選它們的一種標記。除質(zhì)粒外，噬菌體、病毒也能通過“感染”將外源基因帶入細菌并進行復(fù)制。第28頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三目前所使用的質(zhì)粒

目前實驗中所使用的質(zhì)粒、噬菌體和病毒載體種類很多。但都是經(jīng)過了人工改造，更適宜運用于DNA重組技術(shù)。它們既保留了轉(zhuǎn)化和感染活細胞的能力，又具有多處攜帶外源DNA的酶切位點，并含有特殊的篩選標記這些載體中有些只能復(fù)制擴增帶入的外源基因；有些可以使外源基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯出基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，這種載體稱為表達載體第29頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

第30頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三

以噬菌體或病毒為載體，將所需基因或含有此基因的DNA片段轉(zhuǎn)移給受體細胞的過程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們常常采用噬菌體作為基因工程的載體，其一它的遺傳結(jié)構(gòu)與功能知道得比較清楚；其二是易于使細胞感染，易于使外源DNA導(dǎo)入宿主細胞。2.噬菌體——感染細菌的病毒第31頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三以噬菌體為載體進行DNA克隆

DNA用限制性內(nèi)切酶除去中間一段與外源DNA連接重組載體的體外包裝帶有外源DNA的噬菌體太小不能被包裝頭部前體多聯(lián)體DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的顆粒在宿主細胞內(nèi)進行DNA的裝配過程第32頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三三、重組DNA的篩選及表達1.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因的載體進入受體細胞2.篩選——從大量受體細胞選出帶有重組體的細胞3.表達——外源DNA在受體細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯第33頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三1.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因的載體進入受體細胞由質(zhì)粒作載體形成的克隆，轉(zhuǎn)入細菌時細菌預(yù)先要在低溫條件下用氯化鈣處理，形成“感受態(tài)”細胞。即增加細胞膜的通透性才能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由噬菌體作載體的克隆，轉(zhuǎn)入細胞的過程稱為“侵染”。因噬菌體具有自動侵入的功能。細菌不用預(yù)先處理。

第34頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三噬菌體感染大腸桿菌的途徑

第35頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三第36頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三2.篩選——從大量受體細胞選出帶有重組體的細胞（1）插入失活法（2）放射性探針檢測法（3）R-環(huán)檢測法（4）免疫測定法第37頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三（1）插入失活法在現(xiàn)在的基因工程操作中，所使用的載體通常是經(jīng)過加工改造的衍生物，它們要么帶有一個或幾個可供選擇的遺傳標記，要么具有被選擇的遺傳功能，這就使帶有目的基因與不帶目的基因的細菌有明顯區(qū)別，便于篩選。第38頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活第39頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三（2）放射性探針檢測法利用mRNA可與相應(yīng)的DNA段落雜交，來檢測有外源DNA插入的重組體，是一種快速而靈敏的方法。第40頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三第41頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三（3）R-環(huán)檢測法在有利于形成R-環(huán)的條件下，使待檢測的純化的質(zhì)粒DNA，在含有mRNA的緩沖液中局部變性。如若質(zhì)粒DNA存在著與mRNA探針互補的序列，mRNA就會取代DNA中一條鏈，與另一條鏈形成雙鏈雜交分子，從而形成R-環(huán)結(jié)構(gòu)，在電子顯微鏡下觀察，可直接觀察到R-環(huán)。這樣可檢出重組體質(zhì)粒DNA。第42頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三（4）免疫測定法免疫法測定只能是所轉(zhuǎn)移外源DNA必須表達后才能進行，而且必須具備有效的特異性抗體。第43頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三第44頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三Southern和Western印跡法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiography第45頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三3.表達——外源DNA在受體細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯

帶有目的基因的載體轉(zhuǎn)移到受體細胞成功并篩選出來后，最終目的是要目的基因在受體細胞中得以表達，產(chǎn)生具有功能性的蛋白質(zhì)或肽。

第46頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)蛋白質(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程的概念二、蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)三、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用第47頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三一、蛋白質(zhì)工程的概念

蛋白質(zhì)工程(proteinengineering)：通過改造與蛋白質(zhì)相應(yīng)的基因中的堿基順序，或設(shè)計合成新的基因，將它克隆至受體細胞中，通過基因表達而獲得具有新的特性的蛋白質(zhì)技術(shù)1、基因定點突變——定做新蛋白質(zhì)2、蛋白質(zhì)設(shè)計——對天然蛋白質(zhì)的修飾第48頁，共53頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質(zhì)工程舉例：定點突變技術(shù)：已知絲氨酸是由T