Avp－iCre轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)iCre的表達(dá)與行為分析,分子生物學(xué)論文

Avp－iCre轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)iCre的表達(dá)與行為分析,分子生物學(xué)論文原標(biāo)題：Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定內(nèi)容摘要：將Avp-iCre轉(zhuǎn)基因首建小鼠傳到C57BL/6背景。通過(guò)與純合ROSA26Cre報(bào)告小鼠交配來(lái)檢測(cè)iCre〔improvedCre,改良的Cre重組酶〕的表示出，在子代中研究-gal〔beta-galactosidase,-半乳糖苷酶〕與AVP〔argininevasopressin,精氨酸血管加壓素〕的共定位關(guān)系。利用ClockLab軟件記錄分析Avp-iCre小鼠跑輪運(yùn)行行為節(jié)律的完好性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示-gal和AVP在SCN〔suprachiasmaticnucleus,視穿插上核〕的表示出存在明顯共定位；Avp-iCre小鼠具備正常行為節(jié)律，其周期為23.650.14h〔MeanSD〕,表示清楚該Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠可用于近日節(jié)律研究。本文關(guān)鍵詞語(yǔ)：近日節(jié)律；Cre;轉(zhuǎn)基因小鼠近日節(jié)律是一種以近似24h為周期的節(jié)律，起著調(diào)控機(jī)體生命活動(dòng)的作用。這種近日節(jié)律由生物體內(nèi)源性的生物鐘所調(diào)控。華而不實(shí)哺乳動(dòng)物下丘腦的SCN〔suprachiasmaticnucleus,視穿插上核〕是近日節(jié)律的中樞振蕩器[1].近日節(jié)律光系統(tǒng)將光信號(hào)通過(guò)RHT〔retinohypothalamictract,視網(wǎng)膜下丘腦束〕從視網(wǎng)膜傳遞給SCN,進(jìn)而介導(dǎo)光照對(duì)生物鐘的相位調(diào)整[2].SCN具有異質(zhì)性，其神經(jīng)元表示出AVP〔argininevasopressin,精氨酸血管加壓素〕,VIP〔vasoactiveintestinalpolypetide,血管活性腸肽〕和GRP〔gastrinreleasingpeptide,胃泌素釋放肽〕等神經(jīng)多肽。這些神經(jīng)元通常處于SCN的特定部位，在接受視網(wǎng)膜投射和介導(dǎo)SCN鐘功能的輸出方面也存在差異[1].為了進(jìn)一步理解這些神經(jīng)元在SCN相位調(diào)整和功能輸出中的作用，單類(lèi)神經(jīng)元水平上的操作是必需的。Cre-LoxP系統(tǒng)是用來(lái)實(shí)現(xiàn)組織和細(xì)胞特異性基因表示出調(diào)控的重要實(shí)驗(yàn)手段[3],該技術(shù)的應(yīng)用將為研究SCN內(nèi)特定類(lèi)型神經(jīng)元在晝夜節(jié)律中的功能提供有力的工具。AVP是SCN中AVP能神經(jīng)元表示出的神經(jīng)肽，主要分布在SCN的背側(cè)，與VIP〔主要分布在SCN的腹側(cè)〕的表示出部位互補(bǔ)。SCN的AVP神經(jīng)元在晝夜節(jié)律中起到重要作用[4].iCre〔improvedCre,改良的Cre重組酶〕為Cre重組酶的一種優(yōu)化形式，適用于在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中使用[5].作者在獲取由小鼠Avp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表示出Cre轉(zhuǎn)基因小鼠〔Avp-iCre〕的基礎(chǔ)上，對(duì)該小鼠腦內(nèi)iCre轉(zhuǎn)基因的表示出情況以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的行為節(jié)律進(jìn)行了鑒定。1材料和方式方法1.1實(shí)驗(yàn)所需動(dòng)物C57BL/6WT小鼠購(gòu)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物中心；Avp-iCre轉(zhuǎn)基因首建小鼠由南京大學(xué)徐瓔教授贈(zèng)送，每個(gè)基因組含有2個(gè)iCre基因拷貝數(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中，考慮到轉(zhuǎn)基因Cre在細(xì)胞內(nèi)的表示出量通常較低，因而我們利用ROSA26這一Cre報(bào)道小鼠[6]與Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，通過(guò)對(duì)-Gal的表示出分析間接檢測(cè)iCre重組酶在腦內(nèi)的表示出。1.2轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定按(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南〕制備鼠尾基因組DNA作為PCR的模板。挑選Avp-iCre基因型的引物序列為：AVP-F:GTTCAGCCTTGACTCCAT;AVP-R:ATGTCCAT-CAGGTTCTTCC.挑選ROSA26基因型的引物序列為：ROSA-F:AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT;ROSA-R1:GGAGCGGGAGAAATGGATATG;ROSA-R2:GCGAAGAGTTTGTCCTCAACC.1.3iCre重組酶特異性表示出將Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠與ROSA26小鼠交配，在子代中挑選出Avp-iCre+/-;ROSA26+/-雙陽(yáng)小鼠，向第三腦室注射20?gColchicine秋水仙素〔溶于2?LPBS內(nèi)〕,24h后灌流取腦，冰凍切片，然后進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色。實(shí)驗(yàn)中使用的一抗及其生產(chǎn)公司和使用濃度如下：chickenanti--Galactosidase〔Abcam,1:5000〕,rabbitanti-VIP〔Peninsula,1:10000〕,guineapiganti-AVP〔Penin-sula,1:20000〕.二抗為組合使用Alexa/DyLight488和DyLight594標(biāo)記的二抗〔JacksonImmunoRe-search〕,濃度均為1:500.1.4行為記錄自由運(yùn)行行為記錄實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)于安裝有轉(zhuǎn)輪設(shè)備的飼養(yǎng)籠中，飼養(yǎng)條件為DD〔DarkDark,黑暗的〕環(huán)境，動(dòng)物可自由獲取食物和水。跑輪行為記錄和分析均通過(guò)ClockLab〔Actimetrix〕軟件完成。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定Avp-iCre小鼠通過(guò)BAC轉(zhuǎn)基因法獲得。如此圖1所示，5-和3-同源臂將iCre-IERS-LacZ重組到AVPlocus〔AVPBACnumber:RP23-423〕,該載體主要含有Avp啟動(dòng)子元件，iCre基因序列，內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)，LacZ序列，Neo新霉素抗性基因和SV40pA序列等，在BAC上替換原有Avp基因，并經(jīng)受精卵的原核注射獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。Avp-iCre首建小鼠為B6CBF1背景。將該轉(zhuǎn)基因小鼠回交到C57BL/6背景下〔當(dāng)前已傳至第5代〕.在回交經(jīng)過(guò)中通過(guò)PCR法從子代中挑選出Avp-iCre陽(yáng)性小鼠。圖2A所示為Avp-iCre引物PCR結(jié)果：Avp-iCre陽(yáng)性條帶大小為676bp,陰性小鼠則沒(méi)有大小為676bp的條帶。實(shí)驗(yàn)中我們還將Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠與ROSA26報(bào)告基因小鼠進(jìn)行交配，通過(guò)PCR法從子代中挑選出Avp-iCre+/-;ROSA26+/-雙陽(yáng)小鼠，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖2B為ROSA三引物PCR結(jié)果：C57BL/6WT為單條約600bp的條帶；ROSA26+/+純合小鼠為單條約300bp的條帶；而ROSA26+/-雜合小鼠則含兩條條帶，一條約600bp,另一條約300bp.2.2iCre重組酶時(shí)空特異性表示出固然所獲取的轉(zhuǎn)基因小鼠含有LacZ基因，但前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚其表示出量較低，難以通過(guò)免疫組化方式方法檢測(cè)。ROSA26報(bào)告小鼠為常用的Cre轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠。因而，為了檢測(cè)Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠iCre重組酶的時(shí)空特異性表示出，我們將Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠與ROSA26報(bào)告基因小鼠進(jìn)行交配。挑選出Avp-iCre+/-;ROSA26+/-雙陽(yáng)小鼠，灌流取腦并切片，并對(duì)腦片進(jìn)行-gal和AVP,-gal和VIP的免疫熒光雙標(biāo)染色分析。染色結(jié)果〔圖3〕顯示：-gal信號(hào)在SON和PVN區(qū)域與AVP表示出幾乎完全共定位，在SCN區(qū)與AVP表示出也存在著明顯的共定位。表示清楚iCre基因在轉(zhuǎn)基因小鼠SCNAVP神經(jīng)元內(nèi)得以表示出，并介導(dǎo)ROSA26基因座loxP位點(diǎn)間的重組，且有效刪除了2個(gè)loxP之間的片段，進(jìn)而啟動(dòng)了LacZ基因的表示出。SCN區(qū)較低程度的共定位可能是由于即便用Colchi-cine處理，AVP在神經(jīng)元胞體內(nèi)的表示出水平仍然較低。-gal和VIP免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，SCN表示出VIP的細(xì)胞，并沒(méi)有檢測(cè)-gal信號(hào)。上述結(jié)果表示清楚Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠iCre重組酶的表示出有組織特異性且具有活性。圖A1,B1,C1分別顯示的是AVP在SCN區(qū)，SON區(qū)，PVN區(qū)的表示出情況；圖A2,B2,C2分別顯示的是-gal在SCN區(qū)，SON區(qū)，PVN區(qū)的表示出情況；圖A3,B3,C3分別顯示的是AVP和-gal在SCN區(qū)，SON區(qū)，PVN區(qū)的共定位表示出情況。圖D~F分別顯示的是VIP和-gal在SCN區(qū)，SON區(qū)，PVN區(qū)的表示出情況，華而不實(shí)VIP在SON和PVN區(qū)不表示出。圖G和H分別為圖A3和圖D的放大效果。白色標(biāo)尺長(zhǎng)度表示100um.3V:3rdventricle,第三腦室；ox:opticchiasm,視穿插；opt:optictract,視神經(jīng)束；SCN:suprachiasmaticnucleus,視穿插上核；PVN:paraventricularnucleus,室旁核；SON:supraop-ticnucleus,視上核。2.3行為記錄分析共分析了9只Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠〔已經(jīng)回交4代〕在全黑環(huán)境下的運(yùn)行節(jié)律，利用卡方周期圖分析了其自由運(yùn)行節(jié)律周期為23.650.14h〔MeanSD〕,與野生型C57BL/6小鼠〔23.670.17h〕相近[7].圖4列舉了一只Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠在全黑環(huán)境下的跑輪行為記錄〔共30天的記錄結(jié)果〕,該小鼠的行為具備正常生物節(jié)律。3討論當(dāng)前，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠中Cre重組酶表示出的方式方法較多，如mRAN水平上的RT-PCR和原位雜交等；蛋白水平上的免疫組織化學(xué)染色等。但這些方式方法都有各自的缺陷，如mRNA水平上能檢測(cè)到Cre基因能否轉(zhuǎn)錄，但不能確定Cre蛋白能否翻譯；蛋白水平上，Cre免疫組織化學(xué)染色固然能檢測(cè)Cre基因的表示出部位，但不能確定其能否具有重組酶的活性，且轉(zhuǎn)基因Cre在細(xì)胞內(nèi)的表示出量通常較低，Cre抗體特異性效果并不是很好。因而通過(guò)ROSA26報(bào)告小鼠間接驗(yàn)證可能是當(dāng)前最好的一種方式方法。當(dāng)前普遍使用的-gal抗體特異性好，使用此方式方法不僅能夠?qū)M織進(jìn)行免疫組化染色確定其表示出部位，而且能證明表示出的Cre重組酶能否具有活性。本實(shí)驗(yàn)利用Avp-